英文標(biāo)題：Integrated Analysis of Metabolome and Transcriptome Reveals Insights forCold Tolerance in Rapeseed (Brassica napus L.)

發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science

發(fā)表時(shí)間：2021-10-8

影響因子：5.753

發(fā)表單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部油料作物研究所

研究背景

油菜(Brassica napus L.)是世界上重要的油料作物。低溫脅迫(CS)等多種非生物脅迫對(duì)其生產(chǎn)力有顯著影響，嚴(yán)重限制油菜的生長和產(chǎn)量，從而造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失和生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，提高耐 CS 成為農(nóng)業(yè)調(diào)查和作物改良的一個(gè)重要領(lǐng)域。耐寒性是作物抵御低溫的基本特性，尤其是越冬作物。因此，開發(fā)耐冷油菜品種以保證在這種不利條件下的產(chǎn)量是當(dāng)務(wù)之急。

目前，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等高通量組學(xué)方法已被植物研究者廣泛應(yīng)用于研究不同的非生物脅迫，加深了對(duì)不同生物途徑的理解。本研究旨在通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析，確定油菜品種的脅迫響應(yīng)基因、代謝產(chǎn)物和代謝途徑，以了解耐寒(C18)和耐寒(C6)油菜品種的低溫脅迫響應(yīng)和耐寒機(jī)制。本研究為油菜的生長機(jī)制提供了新的見解，研究了油菜抗逆性的影響因素，以促進(jìn)油菜抗逆性品種的選育。

材料方法

材料：2 個(gè)油菜品種，耐寒品種 C18(CT-C18)和冷敏感品種 C6 (CS-C6)，分別冷處理的 0、1、7 天后進(jìn)行取樣，每組樣本設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)

組學(xué)方法：RNA-seq、LC-MS/MS

主要結(jié)果

一、冷脅迫下 C6 和 C18 品種的生理響應(yīng)及代謝譜分析

表型結(jié)果表明，C6 在冷處理 7 天時(shí)表現(xiàn)出比 C18 嚴(yán)重的萎蔫和褪綠。CT-C18 在第 1天和第 7 天的 SOD、POD 等抗氧化酶活性較高，C18 具有更好的抗氧化能力。并且 C18的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量都有顯著升高。以上的現(xiàn)象都表明 C18 可通過增加CS 的抗氧化防御酶活性和滲透保護(hù)劑含量，降低氧化應(yīng)激，是比 C6 更好的耐寒品種。

為了構(gòu)建一個(gè)系統(tǒng)的代謝變化概況，對(duì)冷敏感(CS- c6)和耐寒(CT-C18)品種進(jìn)行了非靶向代謝組分析。共檢測(cè)到代謝物 3,368 種；其中，626 種是已知的代謝物。為了更好地了解CS 對(duì)代謝的影響，建立了無監(jiān)督層次聚類，表明 CS 早期(0 1 天)的代謝數(shù)據(jù)與應(yīng)激后期(7天)明顯分離。PCA 的 PC1 顯示出不同時(shí)間點(diǎn)之間的分離，上述結(jié)果表明，兩品種間的代謝反應(yīng)差異可能是其對(duì)冷脅迫耐受性不同的基礎(chǔ)。

二、兩個(gè)油菜品種間冷反應(yīng)的研究

為了鑒定冷脅迫條件下油菜籽的差異代謝物，作者比較了各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照條件下油菜籽的代謝產(chǎn)物數(shù)量和脅迫水平，C6 樣本的 0、1、7 處理組中分別發(fā)現(xiàn)了 156、357、358 個(gè)差異基因，C18 樣本的 0、1、7 處理組中分別發(fā)現(xiàn)了 182、755、469 個(gè)差異代謝物。而同一處理時(shí)間內(nèi)的兩個(gè)品種間的差異代謝物分別為 429、366、403 個(gè)。值得注意的是，在脅迫時(shí)間點(diǎn)上，兩個(gè)品種的差異代謝物數(shù)量都增加了，這表明了代謝產(chǎn)物對(duì)冷脅迫的積極適應(yīng)。然而，CS 處理 7 天后，CT-C18 體內(nèi)的差異代謝物含量高于 CS-C6，表明 CT-C18 具有較強(qiáng)的代謝紊亂。通過分析兩個(gè)品種在不同時(shí)間點(diǎn)的差異代謝物類型，發(fā)現(xiàn) CT-C18 品種對(duì)脅迫反應(yīng)迅速，隨著脅迫時(shí)間的延長，CT-C18 中上調(diào)的差異代謝物數(shù)量多于 CS-C6，而下調(diào)的差異代謝物數(shù)量與 CS-C6 相似。綜上所述，CS- C6 未能累積到*多的差異代謝物，這可能與 CS 敏感性有關(guān)。相反，CT-C18 在整個(gè)應(yīng)激條件下累積了較多的差異代謝物和較多的上調(diào)差異代謝物。這些數(shù)據(jù)表明，CS- C6 對(duì)冷處理敏感，而 CT-C18 在代謝組水平上對(duì)冷處理表現(xiàn)出顯著的耐受性。

三、油菜品種的核心代謝產(chǎn)物對(duì)冷脅迫有反應(yīng)

在 CS 條件下，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)兩個(gè)品種進(jìn)行了共有和特有的差異代謝物的鑒定。然而，其中一些是已知的代謝物。因此，對(duì)命名的代謝物進(jìn)行不同的比較。無論同一物種在不同的時(shí)間點(diǎn)或不同品種間的比較，都檢測(cè)到相當(dāng)大數(shù)量的差異代謝物。有趣的是，這些結(jié)果表明，與 CS-C6 相比，CT-C18 在同一時(shí)間點(diǎn)的比較中積累了更多的已知差異代謝物。KEGG 分析表明，這些代謝物主要屬于以下幾類:氨基酸代謝、碳水化合物代謝、其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、膜運(yùn)輸、脂類代謝、萜類和多酮類代謝、輔助因子和維生素的代謝、核苷酸代謝、能量代謝。

基于上述研究結(jié)果，本研究重點(diǎn)對(duì)兩個(gè)品種在同一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到的已知差異代謝物進(jìn)行了比較。有趣的是，CT-C18 品種的代謝產(chǎn)物比 CS- c6 品種的代謝產(chǎn)物表達(dá)上調(diào)，表明這些代謝產(chǎn)物在油菜籽對(duì) CS 的耐受和適應(yīng)中發(fā)揮了積極作用。根據(jù) KEGG 注釋，31 個(gè)差異代謝物涉及 19 條通路，包括生物合成通路、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、核苷酸代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝。

四、基于 CS 條件下 C6 和 C18 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析

在轉(zhuǎn)錄組分析中，檢測(cè)到 C6-0 與 C18-0 比較中有 2845 個(gè)差異基因, C6-1 與 C18-1比較中有 3358 個(gè)差異基因, C6-7 與 C18-7 比較中有 2819 個(gè)差異基因。為了預(yù)測(cè)所有 DEG的功能，使用 MapMan 路徑注釋器對(duì)差異基因的代謝進(jìn)行概述。油菜對(duì) CS 的響應(yīng)取決于其遺傳背景。上調(diào)和下調(diào)的 DEG 表達(dá)趨勢(shì)相似。主要表現(xiàn)在次級(jí)代謝，氨基酸，脂質(zhì)、細(xì)胞壁、微量 CHO 和光反應(yīng)途徑。有趣的是，在應(yīng)激 1 天和 7 天時(shí)，大多數(shù)途徑都被發(fā)現(xiàn)富含上調(diào)基因。通過對(duì)油菜代謝途徑的逐級(jí)綜述，可以清晰地展現(xiàn)出油菜在 CS 處理后不同時(shí)間點(diǎn)的具體代謝途徑。

五、響應(yīng)冷脅迫的差異代謝物和差異基因額調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和功能分析

為了了解 CS-C6 和 CT-C18 品種間的差異代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，作者對(duì) C6-0 和 C18-0、C6-1和 C18-1、C6-7 和 C18-7 三個(gè)組的核心差異代謝物與差異基因進(jìn)行了相關(guān)性檢驗(yàn)，并結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。G1 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析表明，meta_908(海藻糖)和 meta_1297(N,N -二乙?；鶜ど锾?聚在一起，共享 19 個(gè)差異基因。然而，這些常見的差異基因在三種比較中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。meta_56(咪唑油乙酸)、meta_190 (犬尿氨酸)、meta_1457(γ -生育三烯醇)和 meta_1678(角鯊烯)分別聚類。G2 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析表明，meta_217（4- 羥基苯基丙酮酸）與冷脅迫下第 0 天和第 7 天的差異基因相關(guān)。G3 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析表明，Meta_291(Alpha-D-葡萄糖)和 meta_481（脫氧腺苷）在脅迫第 1 天關(guān)聯(lián)的差異基因數(shù)目高于第 0 天。G4 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)表明，meta_216(DL 香草甘露聚酸)和 meta_390(N-乙酰-l-苯丙氨酸)聚類，并與共有和特有的差異基因相關(guān)。總之，本研究結(jié)果表明，不同的差異代謝物和差異基因(參與相同的代謝途徑)之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，從而促進(jìn)了油菜對(duì)冷脅迫的耐受和適應(yīng)性。

G1-G4 相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行 GO 富集分析和 KEGG 富集分析。發(fā)現(xiàn)富集的 GO-BP項(xiàng)主要是碳水化合物代謝過程、細(xì)胞氨基酸代謝過程、有機(jī)酸代謝過程、羧酸代謝過程，氧合酸代謝過程。氨基酸和核苷酸、淀粉和蔗糖的代謝的代謝主要富集于不同時(shí)間點(diǎn) 0, 1 和 7天。KEGG 富集分析中，G1 的結(jié)果表明，0、1 和 7 天時(shí)，主要富集在氨基酸和核苷酸的糖代謝。淀粉和蔗糖的代謝也有類似的趨勢(shì)。G2 的結(jié)果顯示，在冷處理的 1 天和 7 天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，氨基酸的生物合成是*顯著和富集的途徑。值得注意的是，2-氧羧酸代謝在冷處理的第 7 天特異性富集。G3 的結(jié)果表明，在冷處理的 0 和 1 天，碳代謝富集，這與相應(yīng)的GO-BP 分析一致。同樣，在 CS 第 1 天，苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、異喹啉生物堿生物合成、曲烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成均富集。GO-BP 和 KEGG 富集分析表明，主要氨基酸和碳水化代謝在油菜 CS 耐受性和適應(yīng)性中起關(guān)鍵作用。

注：低溫脅迫相關(guān)基因與 dam 的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析。G1：“C6-0_vs_C18-0”、“C6-1_vs_C18-1”和“C6-7_vs_C18-7”共有的 10 個(gè)已知差異代謝物；G2：“C6-0_vs_C18-0”和“C6-7_vs_C18-7”共有的 7 個(gè)已知差異代謝物；G3：“C6-0_vs_C18-0”和“C6-1_vs_C18-1”共有的 5 個(gè)已知差異代謝物；G3：“C6-1_vs_C18-1”和“C6-7_vs_C18-7”共有的 9 個(gè)已知差異代謝物。

六、淀粉和蔗糖代謝對(duì) CS 的反應(yīng)

通過 GO 和 KEGG 富集分析表明，在冷脅迫處理下，油菜的許多差異代謝物和差異基因與淀粉和蔗糖代謝相關(guān)。海藻糖和纖維二糖在脅迫過程中積累，表明 CS-C6 應(yīng)保持高于 CT-C18 的海藻糖和纖維二糖水平。同時(shí)，糖原、D-葡萄糖-6P 和 D-果糖-6P 在處理的不同時(shí)間點(diǎn)均被下調(diào)，說明相比 CS-C6，CT-C18 應(yīng)保持較高的水平。熱圖中總結(jié)了參與淀粉和蔗糖代謝途徑的差異基因的表達(dá)模式，這些差異基因與上述 5 個(gè)差異代謝物中的 1-3 個(gè)相關(guān)，并在兩個(gè)品種中均顯示出不同的表達(dá)模式。值得注意的是，與葡萄糖分支直接相關(guān)的三個(gè)差異基因在C6中的表達(dá)水平較低，隨后導(dǎo)致d-葡萄糖-6p在CS-C6中的積累水平較低，其他的糖類變化并不明顯。以上結(jié)果表明，高含量的糖相關(guān)化合物對(duì)油菜的 CS 耐性有顯著的促進(jìn)作用。在冷處理?xiàng)l件下，大多數(shù)負(fù)責(zé)碳水化合物生物合成的基因都表達(dá)上調(diào)，并且在暴露后 1 或 7 天，CT-C18 的變化大于 CS-C6。這表明CT-C18 在積累一些碳水化合物方面表現(xiàn)更好，因此，與 CS-C6 品種相比，表現(xiàn)出更高的 CS 耐受性水平。相反，這些分子水平較低可能導(dǎo)致冷敏感性。

七、苯丙氨酸代謝對(duì) CS 的反應(yīng)

苯丙氨酸代謝在代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中都顯著富集，值得注意的是，在第 0 天和第1 天，只有 2-苯乙酰胺和 n -乙酰- l-苯丙氨酸積累，而在第 7 天，2-羥基苯乙酸、n -乙酰- l-苯丙氨酸、3-苯基丙酸和水楊酸的含量上調(diào)，琥珀酸的含量下調(diào)。參與苯丙氨酸代謝途徑的差異基因的表達(dá)模式見熱圖(圖 10B)。特別是，通過 3 次比較檢測(cè)到 5 個(gè)共有差異基因。其中三個(gè)分別負(fù)責(zé)苯丙氨酸或苯丙酮酸和反式 4-羥基肉桂酸的生物合成的基因表達(dá)下調(diào)。三次比較中，少數(shù)基因表達(dá)上調(diào)(圖 10A)，表明 CT-C18 中差異基因的表達(dá)水平較高。而苯丙氨酸代謝的其他最終產(chǎn)物和中間產(chǎn)物，除 3 個(gè)差異代謝物外，在兩個(gè)品種之間沒有差異。這些結(jié)果表明，油菜籽通過苯丙氨酸代謝來調(diào)節(jié)氨基酸的積累。然而，這些水壩的較高含量，主要是在 CT-C18 中，可能與油菜籽的 CS 耐受有關(guān)。

結(jié)論

通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)分析，作者發(fā)現(xiàn)大量的差異代謝物與幾個(gè)差異表達(dá)基因密切相關(guān)。通過功能富集分析表明，大部分的差異基因和差異代謝物主要富集在不同的碳水化合物和氨基酸代謝中。其中淀粉、蔗糖代謝和苯丙氨酸代謝顯著豐富，對(duì)油菜冷脅迫適應(yīng)起著至關(guān)重要的作用。從低溫適應(yīng)控制的兩條通路中篩選出 6 個(gè)候選基因。在進(jìn)一步驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，對(duì)擬南芥的同源 T-DNA 插入突變體 4cl3, cel5, fruct4, ugp1,axs1, and bam2/9進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn) 6 個(gè)突變體的抗凍性存在顯著差異。本研究結(jié)果為了解油菜低溫脅迫響應(yīng)的分子基礎(chǔ)和耐受機(jī)制提供了新的前景，并為提高油菜低溫脅迫適應(yīng)性提供了一組候選基因。