英文題目：CCR2+ monocytes promote memory CD8+ T-cell differentiation via membrane-bound TGF-β

研究單位：西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院院長(zhǎng)張保軍教授團(tuán)隊(duì)

期刊名：cellular & molecular immunology

影響因子：21.8

樣本類(lèi)型：8-12周齡小鼠

文章采用技術(shù)：空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）

引言

在對(duì)抗感染和腫瘤的免疫戰(zhàn)場(chǎng)上，記憶?CD8+?T?細(xì)胞是守護(hù)機(jī)體的「長(zhǎng)效衛(wèi)士」，?它們能快速識(shí)別再次入侵的病原體或癌細(xì)胞，發(fā)動(dòng)強(qiáng)力攻擊。長(zhǎng)久以來(lái)，樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）被認(rèn)為是主導(dǎo)記憶?T?細(xì)胞分化的核心「指揮官」。研究人員通過(guò)整合單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄（BMKMANU?S1000）技術(shù)，揭示了單核細(xì)胞才是調(diào)控記憶?CD8+?T?細(xì)胞分化的關(guān)鍵「操盤(pán)手」，其奧秘藏在「細(xì)胞接觸」與「分子信號(hào)」的雙重機(jī)制中。其中BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺(tái)大放異彩，成為揭CCR2+單核細(xì)胞促進(jìn)記憶CD8+?T細(xì)胞分化的關(guān)鍵工具。

研究背景

CD8+?T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫中扮演著關(guān)鍵角色，能夠保護(hù)機(jī)體免受病原體感染和消除惡性細(xì)胞。當(dāng)CD8+?T細(xì)胞識(shí)別到抗原后，會(huì)迅速增殖并分化為效應(yīng)CD8+?T細(xì)胞和記憶CD8+?T細(xì)胞。效應(yīng)CD8+?T細(xì)胞負(fù)責(zé)即時(shí)清除感染，而記憶CD8+?T細(xì)胞則提供長(zhǎng)期保護(hù)，能夠在再次遇到相同抗原時(shí)迅速啟動(dòng)免疫反應(yīng)。然而，單核細(xì)胞（monocytes）作為重要的髓系免疫細(xì)胞，雖在炎癥遷移中作用明確，但其是否直接參與T細(xì)胞分化尚無(wú)定論。

研究策略

動(dòng)物模型與樣本制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：優(yōu)先選擇8-12周齡的CD45.1+/CD45.2+及OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠

樣本制備：脾臟單細(xì)胞懸液通過(guò)機(jī)械分離和紅細(xì)胞裂解（ACK緩沖液）制備

技術(shù)手段

• 流式細(xì)胞術(shù)分析

細(xì)胞分選：從感染LM-WT的小鼠脾臟中分選出cDCs、moDCs和單核細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞（APCs）

細(xì)胞刺激與培養(yǎng)：將分選出的APCs與OVA肽段體外共孵育后，過(guò)繼轉(zhuǎn)移到已接受初始OT-I+?CD8+?T細(xì)胞的WT受體小鼠體內(nèi)，或與體外刺激的初始CD8+?T細(xì)胞共培養(yǎng)

表型檢測(cè)：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+?T細(xì)胞的分化表型，包括記憶相關(guān)標(biāo)記物（如cKit、Sca1、Bcl6、TCF1和Eomes）的表達(dá)

• 空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)

樣本處理：對(duì)感染第0天和第5天的小鼠脾臟組織進(jìn)行切片，并進(jìn)行H&E染色以確定組織形態(tài)學(xué)特征

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：利用BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)脾臟切片進(jìn)行分析，揭示不同免疫細(xì)胞亞群在脾臟中的空間分布

數(shù)據(jù)整合：將scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，通過(guò)Seurat等工具的FindTransferAnchors和TransferData函數(shù)，將scRNA-seq中識(shí)別的細(xì)胞類(lèi)型映射到空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類(lèi)型的空間定位

• 免疫熒光染色

樣本處理：對(duì)感染第0天和第5天的小鼠脾臟組織進(jìn)行切片，并進(jìn)行免疫熒光染色

抗體選擇：使用特異性抗體標(biāo)記CD8+?T細(xì)胞、單核細(xì)胞（CCR2+）、樹(shù)突狀細(xì)胞（CD11c+）等關(guān)鍵細(xì)胞類(lèi)型

結(jié)果分析：通過(guò)顯微鏡觀(guān)察并拍攝染色切片，分析不同細(xì)胞類(lèi)型在脾臟中的共定位關(guān)系

• 生物信息學(xué)分析

差異基因分析：利用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法，識(shí)別不同細(xì)胞亞群間的差異表達(dá)基因

通路富集分析：通過(guò)ClusterProfiler等工具對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析，揭示潛在的生物學(xué)過(guò)程

偽時(shí)間分析：利用Monocle3等工具構(gòu)建細(xì)胞分化軌跡的偽時(shí)間軸，分析CD8+?T細(xì)胞亞群在分化過(guò)程中的基因表達(dá)變化

研究結(jié)果

研究結(jié)果一：通過(guò)空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)繪制急性感染后脾組織的圖譜

為了研究免疫反應(yīng)過(guò)程中不同免疫細(xì)胞的空間分布和CD8+?T細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制，研究人員通過(guò)整合單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)，分析了急性感染模型中脾臟免疫細(xì)胞的空間分布與CD8??T細(xì)胞分化機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過(guò)李斯特菌（LM-OVA）感染誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)包括：1）脾臟形成7個(gè)功能集群（B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等）；2）感染后T/B細(xì)胞區(qū)擴(kuò)大，APCs（B細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞）在T細(xì)胞區(qū)外圍聚集；3）空間重組與T細(xì)胞分化（MP/TE亞群）顯著相關(guān)。多組學(xué)整合揭示了免疫微環(huán)境的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制，為理解感染中細(xì)胞互作提供了多組學(xué)視角。

研究結(jié)果二：急性感染期間效應(yīng)和memoryCD8?T細(xì)胞分化軌跡不同

為了探索CD8+?T細(xì)胞分化的空間決定因素，特別是與近端細(xì)胞的相互作用，對(duì)于急性感染模型研究人員進(jìn)行了亞群分析、分化路徑分析和功能驗(yàn)證，結(jié)果表明在急性感染中，IFN反應(yīng)型CD8+?T細(xì)胞和CD8+MP?細(xì)胞之間分化軌跡的不同意味著，效應(yīng)和記憶CD8+?T細(xì)胞的命運(yùn)決定于免疫反應(yīng)的初始階段，而IFN應(yīng)答和MP?CD8+?T細(xì)胞分別是效應(yīng)和記憶CD8+?T細(xì)胞分化途徑的初始階段。

研究結(jié)果三：跨組織區(qū)域細(xì)胞亞群的鑒定和空間圖譜

為了研究脾臟免疫細(xì)胞在感染前后的動(dòng)態(tài)變化，研究人員通過(guò)整合單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)，進(jìn)一步鑒定了供體和受體脾臟中的免疫細(xì)胞群。結(jié)果顯示：①細(xì)胞組成：從1.6萬(wàn)細(xì)胞中鑒定出19類(lèi)，包括CD8??T細(xì)胞亞群（如記憶前體和IFN反應(yīng)性細(xì)胞）及髓系細(xì)胞。②動(dòng)態(tài)變化：感染后第5天，T細(xì)胞區(qū)從以初始CD8+?T細(xì)胞為主轉(zhuǎn)為記憶前體和效應(yīng)細(xì)胞主導(dǎo)，且單核細(xì)胞取代DC成為主要浸潤(rùn)的髓系細(xì)胞。③功能提示：不同的APC和CD8+?T細(xì)胞之間的相互作用在免疫反應(yīng)和CD8+?T細(xì)胞的分化中起著重要作用。

研究結(jié)果四：?jiǎn)魏思?xì)胞和CD8+?MP細(xì)胞的抗原依賴(lài)性共定位

為了探索不同細(xì)胞類(lèi)型之間潛在的細(xì)胞相互作用，研究人員通過(guò)評(píng)估特異性免疫細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)、免疫熒光染色及空間轉(zhuǎn)錄組分析，檢查了第0天和第5天脾臟中CD8+?T細(xì)胞和單核細(xì)胞的空間分布。結(jié)果顯示單核細(xì)胞和CD8+?MP細(xì)胞以抗原刺激依賴(lài)性的方式在空間上共定位，表明單核細(xì)胞可能對(duì)CD8+?MP細(xì)胞的分化有關(guān)鍵影響。

研究總結(jié)

CD8+T?細(xì)胞是適應(yīng)性免疫的重要執(zhí)行者；特別是記憶CD8+?T細(xì)胞對(duì)強(qiáng)效和長(zhǎng)期保護(hù)至關(guān)重要。CD8+?T細(xì)胞分化在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機(jī)制已被廣泛研究。然而，人們對(duì)感染過(guò)程中效應(yīng)和記憶CD8+?T細(xì)胞分化的空間要求仍然知之甚少。研究人員通過(guò)整合BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)和scRNA-seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了記憶CD8+?T細(xì)胞分化的新機(jī)制，該機(jī)制涉及單核細(xì)胞和CD8+?MP細(xì)胞之間的解剖學(xué)鄰近性和TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)。該研究結(jié)果闡述了記憶CD8+?T細(xì)胞命運(yùn)決定的新機(jī)制，并強(qiáng)調(diào)單核細(xì)胞作為關(guān)鍵的APC群體，通過(guò)細(xì)胞間接觸依賴(lài)的方式在感染過(guò)程中促進(jìn)記憶CD8+?T細(xì)胞的分化。