基因組Survey測(cè)序分析
高效，精準(zhǔn)，快速
產(chǎn)品介紹
基因組survey以測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，基于小片段文庫的低深度測(cè)序，通過K-mer分析，快速獲得基因組大小、雜合度、重復(fù)序列比例等基本信息，為制定該物種的全基因組de novo測(cè)序策略提供有效依據(jù)。
調(diào)研圖分析原理
調(diào)研圖分析基于k-mer的方法，所謂k-mer是指將核酸序列以滑窗的方法分成包含k個(gè)堿基的短序列，“mer”這個(gè)單詞的來源monomeric unit，單體單元。K是常數(shù)，且一般為奇數(shù)（避免正反鏈混淆）。統(tǒng)計(jì)所有reads中所出現(xiàn)的k-mer類型及各類型k-mer的深度（或者頻率），繪制特定k-mer下不同深度k-mer片段的頻數(shù)統(tǒng)計(jì)圖，通常選擇K-mer分布最多的峰為主峰，從而得到基因組大小=K-mer總數(shù)/K-mer主峰深度值。
由于基因組存在雜合位點(diǎn)和重復(fù)序列，k-mer曲線往往不會(huì)呈現(xiàn)出良好的泊松分布，而是在主峰前后出現(xiàn)其他的峰，如果存在一定雜合度，會(huì)導(dǎo)致在主峰對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)的二分之一處出現(xiàn)雜合峰，而一定的重復(fù)度則會(huì)在主峰對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)的整數(shù)倍處出現(xiàn)重復(fù)峰。
調(diào)研圖分析內(nèi)容
評(píng)估基因組大?。?/p>
評(píng)估基因組雜合情況；
評(píng)估重復(fù)序列含量；
評(píng)估基因組GC含量；
為后續(xù)精細(xì)圖階段的文庫構(gòu)建提供策略建議。
基因組調(diào)研圖的意義
啟動(dòng)全基因組測(cè)序的必要前提
了解與近緣物種間的基因組差異信息
獲得某物種基因組的基本信息及難易程度
基因組調(diào)研圖報(bào)告
1 項(xiàng)目概況
1.1合同分析內(nèi)容
(1) 測(cè)序得到不低于50倍覆蓋度的數(shù)據(jù)量。
(2) 樣本質(zhì)量評(píng)估：
????a)外源物種污染率評(píng)估；
????b)線粒體含量評(píng)估；
(3) 基因組評(píng)估：
????a) 基因組大小評(píng)估；
????b) 雜合率評(píng)估；
????c) 重復(fù)序列比例評(píng)估；
????d) GC含量評(píng)估。
1.2 分析結(jié)果概述
(1) 測(cè)序獲得xx ?Gb數(shù)據(jù)，總測(cè)序深度約為xx ×，Q20比例達(dá)到xx %以上，Q30比例達(dá)到xx %以上。
(2) 通過與NT庫比對(duì)表明樣品不存在污染。
(3) 對(duì)物種的線粒體評(píng)估，發(fā)現(xiàn)線粒體含量很低。
(4) 估計(jì)基因組的大小約xx Mb，雜合率約xx %，重復(fù)序列含量約xx %。
(5) 估計(jì)基因組的GC含量約xx %。
1.3 項(xiàng)目分析總結(jié)
????????分析表明，樣品不存在外源物種污染，且質(zhì)體含量低，能用于構(gòu)建精細(xì)圖；同時(shí)，估計(jì)基因組大小約xx? Mb，基因組的雜合率約xx %，重復(fù)序列含量約xx %，因此該物種基因組屬于高雜合的復(fù)雜基因組。推薦的測(cè)序方案為xx? ×的270 bp文庫數(shù)據(jù)和xx? ×的20 Kb三代測(cè)序文庫數(shù)據(jù)。見表1。
表1 ??精細(xì)圖文庫建庫方案
| Sequence data | Library | Depth (×) | Data (Gb) |
|---|---|---|---|
| Fragment library | 270 bp (sequenced) | xx | xx |
| Pacbio | 20 Kb | xx | xx |
| Total | — | xx | xx |
2 項(xiàng)目流程
2.1 實(shí)驗(yàn)流程
????????實(shí)驗(yàn)流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)protocol執(zhí)行，包括：DNA文庫制備實(shí)驗(yàn)和測(cè)序?qū)嶒?yàn)。實(shí)驗(yàn)流程見圖1
圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖
????????提取基因組DNA ,進(jìn)行小片段文庫建庫測(cè)序。分為以下四個(gè)步驟：
（1）文庫構(gòu)建：物理破碎法（超聲波震蕩）將合格的基因組DNA破碎至目的片段（270 bp），然后經(jīng)過末端修復(fù)、加A、加接頭、目標(biāo)片段選擇和PCR等步驟構(gòu)建小片段測(cè)序文庫文庫；
（2）文庫質(zhì)檢：利用2100和Q-PCR檢測(cè)文庫片段大小和文庫定量，確定文庫是否符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn) ;
（3）芯片固定：通過橋式PCR將文庫固定到測(cè)序芯片上；
（4）上機(jī)測(cè)序利用Hiseq測(cè)序儀對(duì)文庫進(jìn)行雙端150 bp（PE 150）測(cè)序，測(cè)序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后用于下一步信息分析。
2.2 信息分析流程
雙端測(cè)序數(shù)據(jù)通過評(píng)估雙端測(cè)序數(shù)據(jù)通過評(píng)估（GC分布統(tǒng)計(jì)、質(zhì)量值Q20、Q30評(píng)估）、過濾后得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(clean reads)，用于基因組大小的評(píng)估、基因組的組裝、GC含量的統(tǒng)計(jì)、雜合率的統(tǒng)計(jì)(以及組裝后的評(píng)估)。具體信息分析流程見圖2。
圖2 基因組調(diào)研圖信息分析流程
3 分析結(jié)果
3.1 測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)
????????使用醫(yī)蛭樣品的基因組DNA構(gòu)建270 bp文庫，在 Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序并過濾得到12.43 Gb高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，總測(cè)序深度約為76 ×，測(cè)序數(shù)據(jù)Q20比例均在95.34%以上，Q30比例均在89.23%以上，滿足合同要求的50 ×以上的測(cè)序數(shù)據(jù)量。文庫高質(zhì)量的數(shù)據(jù)量的統(tǒng)計(jì)信息見表2。
表2 ??樣品測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)表
| Library | Data (Gb) | Depth (×) | Q20 (%) | Q30 (%) |
|---|---|---|---|---|
| 270 bp | 8.96 | 54 | 96.27 | 90.93 |
| 270 bp_add | 3.47 | 21 | 95.34 | 89.23 |
| Total | 12.43 | 76 | — | — |
注：Library：調(diào)研圖的測(cè)序文庫；Data (Gb)：相應(yīng)測(cè)序文庫的測(cè)序數(shù)據(jù)量；Depth (×)：測(cè)序深度；Q20 (%)：測(cè)序質(zhì)量值在20以上的堿基比例；Q30 (%)：測(cè)序質(zhì)量值在30以上的堿基比例。
3.2 樣本質(zhì)量評(píng)估
3.2.1 樣品污染評(píng)估
????????樣品如果存在污染不僅會(huì)降低有效數(shù)據(jù)量，同時(shí)還會(huì)影響調(diào)研圖分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致基因組大小、雜合率、重復(fù)序列比例和GC含量等基因組特征評(píng)估結(jié)果出現(xiàn)較大偏差，使得基因組組裝建庫策略出現(xiàn)偏差，最終影響后續(xù)的基因組組裝效果。為了判斷提取的樣品DNA是否受到污染，我們從測(cè)序得到的270 bp文庫中，隨機(jī)取10,000條單端reads，與NT庫進(jìn)行BLAST[1]比對(duì)，270 bp文庫能夠比對(duì)上NT庫的reads分別占總reads數(shù)的1.71%，其中比對(duì)到xx 和xx上的reads數(shù)分別占比對(duì)上NT庫reads數(shù)的34.5%和6.43%，這兩個(gè)物種皆為醫(yī)蛭的近緣物種，且比對(duì)結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)植物等異常比對(duì)，因此該樣品測(cè)序數(shù)據(jù)不存在污染，可用于基因組調(diào)研圖分析。一般的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：如果有一定比例的reads比對(duì)上進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的物種如植物，微生物等，則判斷樣品可能存在污染，需要進(jìn)一步檢查原因。具體比對(duì)統(tǒng)計(jì)表見表3。
表3 ??270 bp文庫NT庫比對(duì)詳表
| Species | Aligned percentage (%) |
|---|---|
| A | 34.5 |
| B | 6.43 |
| C | 2.92 |
| D | 2.92 |
| E | 2.33 |
注：Species：比對(duì)上的物種名稱；Aligned percentage (%)：比對(duì)到該物種的reads占所有比上NT庫reads的比例。
3.2.2 線粒體含量評(píng)估
????????由于線粒體中存在核酸序列，如果物種測(cè)序文庫中線粒體DNA含量過高時(shí)，會(huì)影響后期基因組組裝。因此評(píng)估文庫中線粒體DNA含量對(duì)判斷數(shù)據(jù)能否用于后續(xù)基因組組裝非常必要。為了評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)中線粒體的含量，我們利用Illumina Hiseq測(cè)序得到的270 bp文庫與醫(yī)蛭近緣物種的線粒體序列（42,362 bp）進(jìn)行SOAP[2]比對(duì)。比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙端比上的reads數(shù)為166，占總reads的0.00%，單端比上的reads數(shù)為13，占總reads的0.00%，這兩個(gè)的比例都低于經(jīng)驗(yàn)值5%。由此判斷270 bp文庫測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)體含量很低，不影響后期基因組的組裝。比對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。
表4-1 ??270 bp文庫SOAP比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表
| Type | Aligned reads number | Total reads number | Percentage (%) |
|---|---|---|---|
| Paired-read | 166 | 59,800,490 | 0.00 |
| Single-read | 13 | 59,800,490 | 0.00 |
注：Type：比對(duì)上的reads的類型；Aligned reads number：比對(duì)上的reads條數(shù)；Total reads number：總的reads條數(shù)；Percentage (%)：比對(duì)上的reads占總的比例。
3.3 基因組特征評(píng)估
????????利用基因組調(diào)研圖進(jìn)行基因組特征的評(píng)估，分為四個(gè)方面：
1) 評(píng)估基因組大小;
2) 評(píng)估重復(fù)序列比例；
3) 評(píng)估雜合情況；
4) GC含量情況。
3.3.1 基因組大小、重復(fù)序列比例和雜合率評(píng)估
????????利用270 bp文庫數(shù)據(jù)構(gòu)建k=19的kmer分布圖（見圖3），進(jìn)行基因組大小、重復(fù)序列比率和雜合率的評(píng)估。由圖3知，平均kmer深度即主峰對(duì)應(yīng)的kmer深度為62。kmer深度出現(xiàn)在主峰對(duì)應(yīng)深度2倍以上的序列為重復(fù)序列，即深度大于125的kmer序列為重復(fù)序列。kmer深度出現(xiàn)在主峰對(duì)應(yīng)深度一半處的序列為雜合序列，即深度出現(xiàn)在31附近的kmer序列為雜合序列。根據(jù)kmer深度信息，總kmer數(shù)目/平均kmer深度即為基因組大小，估計(jì)基因組大小約162.99 Mbp。依據(jù)kmer分布情況，估計(jì)重復(fù)序列含量約16.23%，評(píng)估出的雜合率約為1.79%，因此該物種基因組屬于高雜合的復(fù)雜基因組。
圖3 Kmer分布圖
3.3.2 評(píng)估GC含量
????????基因組GC含量對(duì)二代基因組測(cè)序的隨機(jī)性有較大影響。過高(>65%)或過低(<25%)的GC含量會(huì)導(dǎo)致測(cè)序偏向性，嚴(yán)重影響基因組分析結(jié)果。物種GC含量是評(píng)估調(diào)研圖分析準(zhǔn)確性和后續(xù)基因組組裝難度的重要指標(biāo)之一。通過對(duì)調(diào)研圖文庫測(cè)序數(shù)據(jù)分析，該物種基因組的GC含量約38.03%，較為適中，不會(huì)影響調(diào)研圖分析的準(zhǔn)確性。見表5。
表5 ??基因組GC含量評(píng)估
| Species | GC content (%) |
|---|---|
| Hirudo nipponia | 38.03 |
注：Species：物種名；GC content (%)：GC含量。
????????綜上所述，該基因組大小約為162.99 Mb，重復(fù)序列比例約16.23%，雜合率約1.79%，基因組的GC含量約38.03%，從基因組基本結(jié)構(gòu)特征上看，該物種基因組屬于高雜合的復(fù)雜基因組。
參考文獻(xiàn)
其他案例
基因組de novo測(cè)序是什么？
基因組de novo測(cè)序也叫基因組從頭測(cè)序，主要針對(duì)未知物種的基因組序列以及需要更新的基因組，通過構(gòu)建基因組DNA文庫，并進(jìn)行測(cè)序。然后通過生物信息學(xué)的方法對(duì)測(cè)序所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、組裝和注釋，從而獲得該物種完整的基因組序列圖譜。
三代基因組相比二代基因組的優(yōu)勢(shì)有哪些？
三代測(cè)序具有長(zhǎng)度長(zhǎng)的特點(diǎn)，平均讀長(zhǎng)在10-15Kb，而二代測(cè)序的讀長(zhǎng)為PE125-250bp，所以二代測(cè)序在遇到重復(fù)序列，雜合難題時(shí)，就很無力。而三代測(cè)序能有效的解決這些問題。所以三代基因組具有超高的組裝指標(biāo)，組裝錯(cuò)誤率更低，組裝的完整性更好等優(yōu)點(diǎn)。
三代的錯(cuò)誤率高能否用于基因組組裝？
三代的錯(cuò)誤率是隨機(jī)的堿基錯(cuò)誤率，錯(cuò)誤率達(dá)15%，但隨著自身覆蓋度的增加就可以進(jìn)行糾錯(cuò)，當(dāng)覆蓋度在30X以上時(shí)，堿基準(zhǔn)確度達(dá)99.99%以上。所以三代數(shù)據(jù)用于基因組組裝是完全沒有問題的。
基因組的樣品選擇？
基因組精細(xì)圖的樣品要盡量與調(diào)研圖樣品為同一個(gè)體，植物樣品盡量選擇無污染的組培苗、嫩葉等，而動(dòng)物樣品盡量選擇全血或者內(nèi)臟組織。
百邁客技術(shù)優(yōu)勢(shì)
評(píng)估準(zhǔn)確
基因組大小、雜合度、重復(fù)序列比例及倍性判斷精準(zhǔn)，k-mer圖示清晰易懂。
經(jīng)驗(yàn)豐富
林木、草本、海洋、淡水動(dòng)植物等300余種物種類型，擁有逾千例調(diào)研圖項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)。
實(shí)力認(rèn)證
提取建庫+生信分析，實(shí)力穩(wěn)扎穩(wěn)打，輔助參與多篇高質(zhì)量基因組合作文章見刊于國內(nèi)外雜志。
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