單細胞多組學已經(jīng)廣泛應用于腫瘤研究，特別是同時研究細胞染色質(zhì)開放性和基因表達特征，本次給大家推薦的是單細胞多組學技術(shù)在阿爾茨海默癥中的應用。
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發(fā)表期刊：Nature Genetics

影響因子：38.3307

發(fā)表日期：2021-08

摘要

在健康和疾病中，大腦的基因調(diào)控是高度動態(tài)的，協(xié)調(diào)著不同細胞類型之間一系列生物過程。本文展示了一項針對來自晚期阿爾茨海默癥(AD)患者191890個細胞核的多組學單細胞核研究。分析了相同生物樣本中的染色質(zhì)可及性和基因表達，揭示了細胞異質(zhì)性。鑒定了細胞類型特異性、疾病相關(guān)的候選順式調(diào)控元件及其候選靶基因，包括一個與APOE和CLU連接的少突膠質(zhì)細胞相關(guān)調(diào)控模式。闡述了由全基因組關(guān)聯(lián)研究的AD風險位點上特定細胞類型的順式調(diào)控關(guān)系，證明了多組學單細胞核方法的實用性。神經(jīng)膠質(zhì)群體的軌跡分析確定了疾病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如SREBF1及其調(diào)控靶基因。最后，作者還進行了單核共識加權(quán)基因共表達分析，這是一種對稀疏單細胞數(shù)據(jù)穩(wěn)定的共表達網(wǎng)絡(luò)分析策略，并對AD轉(zhuǎn)錄組進行了系統(tǒng)分析。

實驗方法

RNA-seq、snRNA-seq、snATAC-seq、FISH、免疫熒光

背景介紹

人腦由多個不同種類的細胞組成，神經(jīng)細胞和非神經(jīng)細胞協(xié)同工作，完成簡單而高階的任務(wù)。最近的研究已經(jīng)提供了認知正常大腦中神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞群體的更√確的分子特征和識別。然而，對疾病大腦中的異質(zhì)細胞群體的了解仍然很有限，這限制了對疾病背后的生物學過程的理解。神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥(AD)，其特點是大量神經(jīng)元丟失，并伴有膠質(zhì)細胞增生，而特定的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞群在AD病理生理學中的作用尚不清楚。目前僅在小鼠和人類組織上進行了幾項單細胞和單細胞核RNA測序(snRNA-seq)研究，揭示細胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄變化，但這些疾病相關(guān)細胞亞型的調(diào)控因素尚未確定。

此外，已經(jīng)對阿爾茨海默癥進對阿爾茨海默等復雜疾病的GWAS研究表明，從常見變異到遠端調(diào)控元件的遺傳風險占很大比例。這些調(diào)控元件通常是疾病相關(guān)組織中特定細胞類型的區(qū)域。雖然在將GWAS信號與功能基因組學分析(包括批量RNA-seq和高通量測序分析轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)分析(ATAC-seq))交叉方面進行了大量工作，但此類研究的分辨率明顯受到細胞類型異質(zhì)性的限制。將GWAS HITS與細胞類型聯(lián)系起來的一個先決條件是將遠端調(diào)控元件與它們的靶基因聯(lián)系起來。

ATAC-seq是檢測組織內(nèi)開放的染色質(zhì)區(qū)域。迄今為止，單細胞染色質(zhì)可及性技術(shù)，如單核ATAC-seq (snATAC-seq)，很少用于疾病組織的原始樣本，因此，研究人員對同一AD患者死后的腦組織樣本同時進行了snATAC-seq和snRNA-seq，以在表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組水平揭示AD相關(guān)基因調(diào)控程序，并為研究大腦的細胞異質(zhì)性提供了一個新方法，并且能夠揭示特定細胞群中神經(jīng)退化的新途徑。
本文對191890個來自阿爾茨海默癥患者死后腦組織和認知健康對照的細胞核進行了單細胞核多組學分析，通過整合snRNA-seq和snATAC-seq數(shù)據(jù)，從而對阿爾茨海默癥分子層面變化更完善的理解。通過染色質(zhì)可及性分析確定了細胞類型特異性的候選順式調(diào)節(jié)元件(cCREs)，并發(fā)現(xiàn)了疾病相關(guān)的細胞亞群特異性轉(zhuǎn)錄組變化。確定了可能調(diào)節(jié)阿爾茨海默癥基因表達變化的轉(zhuǎn)錄因子。此外，在整合的數(shù)據(jù)上進行了偽時間軌跡分析。然后將候選的阿爾茨海默癥風險位點的精細定位的GWAS信號與snATAC-seq數(shù)據(jù)整合，將阿爾茨海默癥風險信號與它們可接近的特定細胞類型聯(lián)系起來，并確定了這些位點的順式調(diào)控染色質(zhì)可接近網(wǎng)絡(luò)。此外，由于網(wǎng)絡(luò)分析在闡明組織水平RNA-seq數(shù)據(jù)中的疾病轉(zhuǎn)錄組特征方面是有效的，研究人員設(shè)計了一個共表達網(wǎng)絡(luò)分析通路，整合了單細胞和批量RNA-seq數(shù)據(jù)，在每種細胞類型中識別了AD相關(guān)的共表達網(wǎng)絡(luò)。

結(jié)果

一、人類前額葉皮質(zhì)的多組學分析

研究者進行了snATAC-seq (10×Genomics；12例晚期AD、8例對照)和snRNA-seq (10×Genomics v3；11例晚期AD、7例對照組)，使用從晚期AD患者和年齡匹配的認知健康對照組(74-90歲以上；圖1a)。根據(jù)Braak分期和斑塊分期定義了晚期AD和對照。從同一組織樣本分別生成轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學數(shù)據(jù)，以減少兩種方法之間的細胞類型組成差異。經(jīng)過質(zhì)控過濾后，對130418個細胞核進行snATAC-seq，61472個細胞核進行snRNA-seq。為了保證研究的嚴謹性，對這兩種方法的數(shù)據(jù)采用了批量校正。對于snATAC-seq，使用了相互最近鄰(MNN)來校正潛在的semantic indexing來降低的染色質(zhì)可達性；對于snRNA-seq，使用了整合非負矩陣因子分解(iNMF)來降維，同時消除批次效應。將UMAP降維和Leiden聚類應用到批量校正的表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，在snATAC-seq和snRNA-seq中識別到了不同的細胞類型(圖1b、c)。利用snATAC-seq，分析了腦的所有主要細胞類型——興奮性神經(jīng)元(24076個細胞核，EX.a-e)、抑制神經(jīng)元(9644個細胞核，INH.a-d)、星形膠質(zhì)細胞(15399個細胞核，ASC.a-f)、小膠質(zhì)細胞(12232個細胞核，MG.a-e)、少突膠質(zhì)細胞(62253個細胞核，ODC.a-m)和少突膠質(zhì)細胞前體細胞(4869個細胞核；OPC.a)，基于已知標記基因啟動子區(qū)域的染色質(zhì)可及性進行注釋。同時使用chromVAR通過估算可訪問染色質(zhì)區(qū)域的TF結(jié)合基序的富集來計算單細胞核內(nèi)TF基序的變異性，并檢測了依據(jù)細胞類型劃分的TF基序的富集情況，確定了在星形膠質(zhì)細胞、興奮性神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞中隨著疾病發(fā)生而富集增加的幾種TF基序。此外，對TF足跡進行分析，以進一步闡明細胞類型特異性TF調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX9 TF足跡在少突膠質(zhì)細胞中的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)在興奮性神經(jīng)元中TF motif富集了少突細胞相關(guān)的TF。同樣，使用snRNA-seq-檢測到了類似的細胞類型——興奮性神經(jīng)元(6369個細胞核，EX1-5)、抑制神經(jīng)元(5962個細胞核，INH1-4)、星形膠質(zhì)細胞(4756個細胞核，ASC1-4)、小膠質(zhì)細胞(4126個細胞核，MG1-3)、少突膠質(zhì)細胞(37052個細胞核，ODC1-13)和少突膠質(zhì)細胞前體細胞(2740個細胞核，OPC1-2)，通過細胞類型標記基因的表達進行分類(圖1e)。在這兩種檢測中，少突膠質(zhì)細胞都是常見的細胞類型。此外，雖然每種主要細胞類型中的許多差異表達基因(DEGs)與以前的文獻一致，但也發(fā)現(xiàn)先前被確定為神經(jīng)元或膠質(zhì)亞型標記的細胞分群特異性基因。

由于表觀基因組圖譜與下游基因表達信號深度交織在一起，研究人員使用了Seurat的整合平臺整合了snATAC-seq和snRNA-seq數(shù)據(jù)(圖1f)。在整合的UMAP空間時將染色質(zhì)數(shù)據(jù)或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獨立分類的細胞類型整合在了一起(圖1g)。在snATAC-seq和snRNA-seq中使用相同的生物樣本，導致來自這兩個數(shù)據(jù)模擬動態(tài)的細胞核在共同構(gòu)建的空間中高度重疊。

圖1單核ATAC-seq和單核RNA-seq在研究病變腦細胞多樣性中的應用

二、阿爾茨海默癥中細胞異質(zhì)性的多組學特征

在snATAC-seq和snRNA-seq中，發(fā)現(xiàn)了多個神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞亞群，并基于之前鑒定的標記基因?qū)nRNA-seq中的亞群進行了注釋(圖2)。對于snATAC-seq聚類，研究人員使用的是Seurat的標記轉(zhuǎn)移算法來計算聚類預測值。研究人員對疾病組的每個分群的組成進行分析，與對照相比在AD晚期中發(fā)現(xiàn)了一些明顯的過高或過低組分(圖2d-g)，并且在兩種數(shù)據(jù)中結(jié)果類似。ASC3 (GFAPhigh/CHI3L+) 隨疾病程度比例顯著增加，而ASC4 (GFAPlow/WIF1+/ ADAMTS17+) 顯著降低。這與最近對患AD的小鼠5XFAD模型的snRNA-seq研究一致。研究人員還發(fā)現(xiàn)MG.a和MG.b在AD晚期增加，兩者都定位到激活的snRNA-seq聚類的MG1 (SPP1high/CD163+)，且隨疾病的加重而增加。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)免疫少突膠質(zhì)細胞簇ODC13在AD晚期顯著增加。

圖2.人類AD前額葉皮質(zhì)中不同的表觀遺傳學和轉(zhuǎn)錄差異細胞亞群

三、晚期阿爾茨海默癥的細胞類型特異性順式基因調(diào)控

基于研究人員在同一樣本中同時使用snATAC-seq和snRNA-seq的實驗設(shè)計，研究人員推測可以在特定的細胞群體中確定cCREs的靶基因。為此，研究人員通過在每一種細胞類型中分別為AD晚期和對照樣本構(gòu)建順式共可及網(wǎng)絡(luò)(CCANs)來闡明AD晚期PFC的順式調(diào)控結(jié)構(gòu)。

為了識別cCREs的靶基因，研究人員將重點放在了共可及peaks上，選定其中位于啟動子元件中的peaks，得到了一組cCREs和候選靶基因。研究人員將候選靶基因的表達與cCRE的染色質(zhì)可及性關(guān)聯(lián)起來，旨在研究潛在調(diào)控關(guān)系的，而不僅僅是共可及性。最后，研究人員使用NMF根據(jù)這些基因連鎖的cCRE(gl-cCRE)在每個細胞分群中的染色質(zhì)可及性進行分析和聚類?？偠灾?，對于晚期AD和對照樣本中的每一種主要細胞類型，這種方法導致了一組候選增強子元件(gl-cCRE)以及一組cCRE連鎖的基因被分組到功能模塊中。

總的來說，使用這種方法共鑒定了56552個gl-cCREs和11440個cCREs連鎖基因，每個基因的中位數(shù)為4個cCREs(圖3a)。通過檢查在每個細胞類型中鑒定的cCREs連鎖基因組之間的重疊，研究人員發(fā)現(xiàn)，除了那些細胞類型特異性的基因外，還有大量具有連鎖cCRE的基因在多種細胞類型中共享(圖3b)。在一些細胞類型中，研究人員發(fā)現(xiàn)cCREs連鎖基因與細胞類型標記DEGs以及該細胞類型中在AD中上調(diào)的基因之間存在顯著重疊，這表明cCREs在疾病相關(guān)基因表達變化中發(fā)揮關(guān)鍵作用(圖3c)。研究人員還研究了這些gl-cCREs的每個snATAC-seq分群的染色質(zhì)可及性，并發(fā)現(xiàn)到細胞類型和分群高度特異性(圖3d)。大部分gl-cCREs定位于內(nèi)含子區(qū)域(58.35%；圖3e)。此外，通過檢查NMF系數(shù)矩陣(H)，研究人員能夠識別每個NMF模塊對應的分群或細胞類型，并注釋了幾個特定于控制晚期AD細胞核的模塊(圖3f、g)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)一些在多種細胞類型中共有的cCRE靶基因在每種細胞類型中受不同的cCRE調(diào)控。

 

圖3.將順式調(diào)控元件連接到特定細胞類型中的下游靶基因

 

四、晚期阿爾茨海默癥中的細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子

為了補充對順式調(diào)節(jié)元件的分析，研究人員在晚期AD中識別了特定細胞類型的反式調(diào)節(jié)元件。TFs在神經(jīng)發(fā)育過程中嚴格控制細胞命運，并與神經(jīng)退化過程有關(guān)。研究人員分析了小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)移因子SPI1(也稱為PU.1)和核呼吸因子1(NRF1)在少突膠質(zhì)細胞中的調(diào)節(jié)作用(圖4a-f)。snATAC-seq小膠質(zhì)細胞分群中的SPI1基序可變性只在上調(diào)的MG.a和MG.b中顯著增加，但SPI1的靶基因在只有MG1中顯著下調(diào)(圖4a、b)。研究人員還發(fā)現(xiàn)NRF1在特定的少突膠質(zhì)細胞分群中表達失調(diào)(圖4d-f)。這些結(jié)果表明，SPI1在晚期AD中起轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用。此外，NRF1已被認為與線粒體功能相關(guān)，NRF1調(diào)節(jié)失調(diào)所介導的線粒體功能受損可能通過破壞髓鞘形成而導致晚期AD的神經(jīng)元功能障礙。

為了進一步探究晚期AD中TF介導的基因調(diào)控，研究人員構(gòu)建了特定細胞類型的TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對于特定的TF，研究人員確定了候選目標基因，即其啟動子或連鎖的cCRE是可訪問的，并且在目標細胞類型中包含TF的結(jié)合基序的基因，研究人員對幾個選定的TF重復了這一過程，產(chǎn)生了小膠質(zhì)細胞特異性和少突膠質(zhì)細胞特異性的TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖4g，h)。在這些網(wǎng)絡(luò)中，研究人員發(fā)現(xiàn)了多個AD DEGs，除了位于已知AD GWAS位點的基因外，還受到小膠質(zhì)細胞中的SPI1和少突膠質(zhì)細胞中的NRF1的調(diào)控。

 

圖4. AD晚期中細胞亞群特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控

 

五、疾病相關(guān)膠質(zhì)細胞的綜合軌跡分析

為了進一步揭示阿爾茨海默癥膠質(zhì)細胞異質(zhì)性的分子機制，研究人員使用Monocle3進行了偽時間軌跡分析。在少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中整合的snATAC-seq和snRNA-seq數(shù)據(jù)。多組軌跡分析能夠研究在細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的連續(xù)體中基因表達、染色質(zhì)可及性和TF基序可變性的動態(tài)。研究人員使用遞歸變異自動編碼器(RVAE)對基因表達和染色質(zhì)可及性動態(tài)進行建模。對于每種細胞類型，研究人員確定了沿著軌跡差異表達的基因(t-DEGs)。

六、少突膠質(zhì)細胞軌跡顯示SREBF1失調(diào)

研究人員使用snATAC-seq的58221個細胞核和snRNA-seq的36773個細胞核構(gòu)建了一個完整的少突膠質(zhì)細胞軌跡(圖5a)，發(fā)現(xiàn)AD晚期樣本的細胞核比例似乎沿著軌跡增加(圖5b)。為了闡明與晚期AD相關(guān)的少突膠質(zhì)細胞的功能狀態(tài)，研究人員檢測了新形成的少突膠質(zhì)細胞(NF-ODCs)、髓鞘形成的少突膠質(zhì)細胞(MF-ODCs)和成熟的少突膠質(zhì)細胞(圖5c)。研究人員發(fā)現(xiàn)成熟ODC基因表達特征在軌跡的末端增加，而MF-ODC基因表達特征減少。此外，NF-ODC基因標記在整個軌跡中全部降低，這表明少突膠質(zhì)細胞偽時間軌跡再現(xiàn)了少突膠質(zhì)細胞成熟過程。9231個少突膠質(zhì)細胞gl-cCREs的染色質(zhì)可及性和1563個用RVAE重建的少突膠質(zhì)細胞t-DEGs的基因表達表明，大量的染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄重編程可能是少突膠質(zhì)細胞成熟的基礎(chǔ)(圖5d)。

此外，RVAE得到的潛伏特征空間提供了對疾病中的偽時間軌跡和基因調(diào)控的進一步生物學觀察(圖5e)。每個點代表一個單一的特征(基因或染色質(zhì)區(qū)域)。研究人員根據(jù)每個功能在軌跡上達到*大值75%的位置對其進行排名，研究人員稱之為該功能的“軌跡排名”。然后，研究人員將重建特征軌跡(如圖5d)與晚期AD細胞核的比例進行對比(如圖5b)，查看哪些特征與AD持續(xù)變化。對于基因(t-DEGs)和染色質(zhì)區(qū)域(gl-cCREs)，潛在空間明確地將與晚期AD細胞核比例正或負相關(guān)的特征分組在一起，并將具有相似軌跡等級的特征分組在一起，這表明了該RVAE模型在分析和解釋多組偽偽時間動力學方面的是可行的。

少突膠質(zhì)細胞中的兩個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子：NRF1和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBF1)。SREBF1在調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，有人認為Aβ可以抑制SREBF1的激活。研究人員發(fā)現(xiàn)，在晚期AD的少突膠質(zhì)細胞中，NRF1基序可變性上調(diào)(圖4d)，而SREBF1基序可變性隨疾病的發(fā)生而下調(diào)。研究人員將TF基序可變性軌跡與重構(gòu)的t-DEG表達軌跡相關(guān)聯(lián)，并可視化了TF與2D潛在空間內(nèi)每個基因之間的相關(guān)性，確定了由TF結(jié)合激活或抑制的候選靶基因(分別為正或負軌跡相關(guān)性；圖5f)。發(fā)現(xiàn)NRF1與軌跡末端的靶基因呈負相關(guān)，而SREBF1與軌跡開始和末端的靶基因呈正相關(guān)，表明SREBF1在整個軌跡中起著轉(zhuǎn)錄激活因子的作用。

 

圖5.多染色體少突膠質(zhì)細胞軌跡分析

 

?七、小膠質(zhì)細胞軌跡定義疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細胞

對少突膠質(zhì)細胞軌跡分析使用相同的分析方法，對snATAC-seq的10768個核和snRNA-seq的4119個細胞核構(gòu)建了一個完整的小膠質(zhì)細胞軌跡(圖6a)。晚期AD樣本的細胞核比例在整個小膠質(zhì)細胞軌跡中顯著增加(圖6b)。疾病相關(guān)小膠質(zhì)細胞(DAM)的基因特征進行了分析。DAM是AD相關(guān)的吞噬小膠質(zhì)細胞，在TREM2依賴和TREM2依賴的階段依次激活。
整合小膠質(zhì)細胞的軌跡伴隨著穩(wěn)態(tài)特征的減少，階段1的DAM特征的增加和階段2依賴于TREM2的DAM特征的明顯的耗損(圖6c)，表明這種小膠質(zhì)細胞軌跡從穩(wěn)態(tài)到疾病相關(guān)細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程中的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變化。

為了進一步剖析小膠質(zhì)細胞的軌跡，再次用RVAE(圖6d、e)分別對9163個小膠質(zhì)細胞gl-cCRE和2138個小膠質(zhì)細胞t-DEG的染色質(zhì)可及性和基因表達動態(tài)進行了建模。對ETS家族轉(zhuǎn)錄因子——SPI1和ETS變體5(ETV5)進行分析，這兩個家族在AD晚期都顯示出基序可變性以及候選靶基因的上調(diào)(圖6f)。還觀察到SPI1基序軌跡與軌跡末端的基因呈負相關(guān)，即SPI1在晚期AD中起到抑制因子的作用。

八、人類阿爾茨海默癥中與疾病相關(guān)的星形膠質(zhì)細胞

利用snATAC-seq的12112個細胞核和snRNA-seq的4704個細胞核構(gòu)建了一個完整的星形膠質(zhì)細胞軌跡(圖6h)，同時發(fā)現(xiàn)AD晚期細胞核的比例在整個軌跡中顯著增加(圖6h)。與小膠質(zhì)細胞軌跡中的DAM信號的分析結(jié)果類似。研究人員研究了疾病相關(guān)星形膠質(zhì)細胞(DAAs)的基因信號，基于DAA基因特征分析，推斷這一軌跡遵循從GFAP低態(tài)到GFAP高態(tài)與DAA狀態(tài)的趨勢相似(圖6i)。
12487個星形細胞gl-cCRE和1797個星形細胞t-DEG的RVAE模型顯示了整個軌跡中富集的基因調(diào)控動力學(圖6j、k)。研究人員對星形膠質(zhì)細胞t-DEGs與兩種轉(zhuǎn)錄因子進行了研究：CCCTC-binding factor (CTCF)和FOSL2，發(fā)現(xiàn)這兩種因子的基序變異性在AD晚期分別下調(diào)和上調(diào)。CTCF被認為是一個主要的染色質(zhì)調(diào)控因子，研究發(fā)現(xiàn)CTCF基序可變性軌跡與DAA和GFAPhigh信號呈負相關(guān)，而與該軌跡GFAP-low的t-DEGs呈正相關(guān)(圖6l)。另外研究人員發(fā)現(xiàn)FOSL2的基序變異軌跡與GFAP-high和DAA基因信號呈正相關(guān)，并與軌跡末端的基因呈正相關(guān)(圖6l)。這些發(fā)現(xiàn)表明FOSL2可能是DAA信號的激活因子，而CTCF可能促進星形膠質(zhì)細胞處于進穩(wěn)態(tài)或非病變星形膠質(zhì)細胞狀態(tài)。通過將基因表達與TF基序富集、TF結(jié)合位點可及性聯(lián)系起來，以及利用RVAE得到的時間信息，揭示了TF在調(diào)節(jié)細胞狀態(tài)(如DAA)中的作用。

圖6.多染色體小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞軌跡分析

九、細胞類型特異性順式調(diào)控在阿爾茨海默癥遺傳風險位點

為了進一步探究AD遺傳風險信號，研究人員使用AD和其他相關(guān)性狀的GWAS匯總統(tǒng)計數(shù)據(jù)，對snATAC-seq聚類進行細胞類型特異性連鎖不平衡評分回歸分析(LDSC)。Kunkle等人的研究表明，小膠質(zhì)細胞MG.b和MG.c對AD GWAS SNPs有顯著的富集作用，Jansen等人的研究中5個小膠質(zhì)細胞簇均顯著富集(MG.a、MG.e、MGb、MG.c和MG.d)，其中除了來自AD患者的數(shù)據(jù)外，還包括家族性AD-by-proxy樣本(圖7a)。GWAS遺傳分析的結(jié)果支持了之前在非患病人類和小鼠中的snATAC-seq數(shù)據(jù)。研究人員沿著小膠質(zhì)細胞的偽時間軌跡進行了研究，觀察到整個小膠質(zhì)細胞軌跡遠端peaks的gchrom VAR偏差分數(shù)顯著增加(圖7b、c)，這與類似基因-近端peaks分析的偏差分數(shù)顯著下降形成鮮明對比，這表明DAM中遠端增強子上具有與AD相關(guān)的SNPs。通過將共可及性圖與染色質(zhì)可及性信號和沿基因組軸的GWAS統(tǒng)計疊加，研究人員揭開了GWAS基因中被致病變異破壞的潛在順式調(diào)控關(guān)系，如BIN1、ADAM10、APOE和SLC24A4(圖7d-i)。研究人員發(fā)現(xiàn)APOE基因座是研究AD遺傳性的主要決定因素，也是目前研究得詳細的AD風險基因座之一，其在疾病中小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中具有順式調(diào)控染色質(zhì)網(wǎng)絡(luò)改變的作用。

圖7.阿爾茨海默癥患者腦內(nèi)GWAS基因座的細胞類型特異性調(diào)控格局

十、scWGNCA的單細胞共表達網(wǎng)絡(luò)

為了將snRNA-seq數(shù)據(jù)在系統(tǒng)框架中重新定義，研究人員開發(fā)了一種加權(quán)基因共表達分析(WGCNA)的單細胞數(shù)據(jù)的基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析方法，WGCNA是一種用于識別疾病相關(guān)基因模塊的強大分析方法，最初是為批量基因表達數(shù)據(jù)設(shè)計的。研究人員對其進行了修訂，其中“meta-cells”是通過使用特定細胞群體中k-nearest neighbors計算50個相鄰細胞的平均表達來構(gòu)建的。Mathys等人發(fā)表的的AD snRNA-seq數(shù)據(jù)進行了重新處理，并使用iNMF將這些數(shù)據(jù)與其snRNA-seq數(shù)據(jù)整合。此外，研究人員對早期和晚期AD樣本以及對照樣本進行了批量RNA-seq。最后，研究人員使用WGCNA對不同時期的人類PFC的snRNA-seq數(shù)據(jù)和批量RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建的meta-cells聯(lián)合形成了共表達網(wǎng)絡(luò)。

研究人員對少突膠質(zhì)細胞的scWGCNA分析進行了重點研究，發(fā)現(xiàn)了四個與AD診斷顯著相關(guān)的共表達模塊——OM1、OM2、OM4和OM5(圖8a、b)。例如，AD下調(diào)模塊OM1的hub基因編碼核糖體亞基(例如，RPS15A、RPL30和RPL23A)，與它對蛋白質(zhì)合成和分選相關(guān)GO富集一致。已知OM2基因成員MAG、CNP和PLP1參與髓鞘形成，研究人員發(fā)現(xiàn)OM2隨著疾病的發(fā)生而下調(diào)。
此外，研究人員在共表達網(wǎng)絡(luò)中檢查了SREBF1的下游調(diào)控靶基因。隨后又發(fā)現(xiàn)其中三個少突膠質(zhì)細胞顯著富集了SREBF1的靶基因，這表明SREBF1在調(diào)節(jié)這些模塊中的基因表達方面發(fā)揮重要作用(圖8c)。將批量RNA-seq、高通量蛋白質(zhì)組學、SREBF1-ChIP)以及ChIP-seq的數(shù)據(jù)確定了SREBF1靶基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)SREBF1靶基因模塊的基因表達量在AD早期和晚期樣本的蛋白和RNA中下調(diào)(圖8d)，證實snATAC-seq SREBF1基序的可變性。通過RNA原位雜交和免疫組織化學方法驗證了SREBF1在晚期AD中的下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)ACSL4的表達在晚期AD中有所降低，ACSL4是ENCODE Chip-Seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的SREBF1的靶點之一 (圖8e-g)?？傮w而言，研究人員的共表達網(wǎng)絡(luò)分析方法有助于識別細胞類型特異性疾病，在少突膠質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)了TF SREBF1，這在AD中基本上沒有研究過，表明其研究方法能夠?qū)膊‘a(chǎn)生新的見解。

圖8.批量和單細胞共表達網(wǎng)絡(luò)分析揭示的基因表達模塊

討論

對晚期阿爾茨海默癥的綜合多組學分析為了解疾病發(fā)病機制提供了一個獨特的視角，揭示了疾病發(fā)病機制下細胞異質(zhì)性的連續(xù)性。√確定位復雜疾病的致病機制需要在表觀基因組和轉(zhuǎn)錄水平上對細胞群體特異性基因調(diào)控系統(tǒng)有深入的理解。雖然單細胞染色質(zhì)的可及性可以提供對疾病的重要見解，但由于其固有的稀疏性，研究人員通過整合相同樣本的單核開放染色質(zhì)和單核轉(zhuǎn)錄組，以及使用聚類進行批量可及性分析和共可及性分析，避免了稀疏性問題。考慮到這些因素，多組學分析能夠分析神經(jīng)退行性病變中特定細胞類型的表觀基因組失調(diào)，破譯了人類AD中單細胞核轉(zhuǎn)錄組。
研究人員發(fā)現(xiàn)了特定細胞類型的gl-cCRE，它可能介導晚期AD的基因調(diào)控，也可能與特定細胞類型中的gl-cCRE的TF結(jié)合。雖然cCRE可以僅用表觀遺傳學數(shù)據(jù)來鑒定，但他們的分析是通過整合單核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來證實的，因為研究人員將候選靶基因的基因表達與CCRE染色質(zhì)的可及性聯(lián)系起來。之前對AD的研究還沒有探索細胞類型或細胞亞群水平的順式基因調(diào)控。研究人員強調(diào)了晚期AD中順式基因和反式基因調(diào)控的紊亂，為進一步研究AD提供了潛在的靶點，如少突膠質(zhì)細胞中的NRF1和星形膠質(zhì)細胞及其相應的gl-cCRE中的FOSL2。此外，研究人員檢查了多組學數(shù)據(jù)中的順式調(diào)控相互作用，以闡明GWAS與遺傳性AD風險相關(guān)的細胞類型和疾病特異性基因表達模式。研究人員比較了AD和對照細胞群體之間的順式調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，確定了在疾病中唯一的相互作用。因此，這項研究為更廣泛的AD研究提供了一個資源，未來可以探索感興趣的基因和基因組區(qū)域的細胞類型以及細胞狀態(tài)特異性調(diào)控圖譜。

此外，對少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)圖譜的獨立和聯(lián)合分析顯示，AD的基因調(diào)控和生物學途徑受到干擾。研究人員分析了一個少突膠質(zhì)細胞的軌跡，并評估了新形成的少突膠質(zhì)細胞向成熟少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變過程中的基因表達特征，觀察到該軌跡似乎與少突膠質(zhì)細胞成熟的發(fā)育方向一致。研究人員還發(fā)現(xiàn)在晚期AD中SREBF1基序的變異性降低，表明疾病中可與SREBF1結(jié)合的位點減少，而且SREBF1基因在AD少突膠質(zhì)細胞中的表達也下調(diào)。軌跡分析表明，SREBF1基序的可變性與整個軌跡中的t-DEGs呈正相關(guān)，表明它在少突膠質(zhì)細胞中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活因子的作用。

共表達網(wǎng)絡(luò)分析方法（如WGCNA）已被廣泛應用于海量基因表達數(shù)據(jù)中的疾病相關(guān)基因的研究，然而，這些方法很少用于單細胞轉(zhuǎn)錄學，本文研究人員開發(fā)了scWGCNA，它利用聚集的meta-cells來減弱單細胞基因表達的稀疏性。研究人員利用scWGCNA聯(lián)合分析了snRNA-seq和批量RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了人類AD中的基因共表達網(wǎng)絡(luò)。scWGCNA鑒定了三個SREBF1富集靶基因的少突膠質(zhì)細胞模塊，并表明這些靶基因和蛋白的表達在AD晚期降低。通過對少突膠質(zhì)細胞中SREBF1的共表達和軌跡分析，SREBF1顯然是一個后續(xù)具有重要研究價值的基因，作為AD治療的候選靶點，也證明了研究人員的分析方法在確定新疾病基因靶點方面的實用性。

雖然散發(fā)性阿爾茨海默癥的致病分子機制仍不清楚，但研究人員的研究成果提供了新的見解，有助于揭示阿爾茨海默癥基因調(diào)控的本質(zhì)。但還需要解決阿爾茨海默癥和神經(jīng)退行性變中基因表達和表觀基因組學的復雜性的問題。這里提供的數(shù)據(jù)是理解疾病大腦中調(diào)節(jié)關(guān)系的寶貴資源，其分析的框架為挖掘單細胞多組學數(shù)據(jù)、發(fā)現(xiàn)復雜特征提供了藍圖。

 

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