2021年7月，百邁客和浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院合作文章“Lack of MECP2 gene transcription on the duplicated alleles of two related asymptomatic females with Xq28 duplications and opposite X‐chromosome inactivation skewing”發(fā)表于期刊Human Mutation（IF：4.878）。其中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異及功能分析、外顯子測序分析等由百邁客完成，此外百邁客業(yè)務(wù)還包括單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞ATAC&GEX、單細(xì)胞免疫組庫等，有興趣的老師可以聯(lián)系當(dāng)?shù)劁N售。

導(dǎo)讀

研究背景：

Xq28重復(fù)綜合征（MDS）是一種嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育障礙。癥狀和體征包括嬰兒張力過低、精神運(yùn)動發(fā)育遲緩、嚴(yán)重智力殘疾、言語發(fā)育不良、進(jìn)行性痙攣、反復(fù)呼吸道感染和男性癲癇發(fā)作。MDS是由甲基CpG結(jié)合蛋白2基因（MECP2）的重復(fù)（或三倍）引起的，其增加轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MeCP2的表達(dá)。如小鼠模型和人類所示，MeCP2蛋白過度表達(dá)可能對大腦發(fā)育和功能產(chǎn)生有害影響。
最初，MDS被認(rèn)為只在男性中出現(xiàn)，而大多數(shù)重復(fù)的女性是無癥狀攜帶者。然而，后來的報告顯示，20多名MECP2重復(fù)的受影響女性存在輕度至嚴(yán)重的臨床表型。

X染色體失活（XCI）是X染色體的一種轉(zhuǎn)錄沉默機(jī)制，由XIST的轉(zhuǎn)錄啟動。XCI通過募集染色質(zhì)重塑酶復(fù)合物誘導(dǎo)漸進(jìn)表觀沉默。一條X染色體在女性個體中隨機(jī)失活，但一些女性表現(xiàn)出兩條X染色體之一的傾斜失活（shewed XCI）。傾斜的XCI可導(dǎo)致女性X連鎖疾病的表型異質(zhì)性。MECP2是一個受XCI影響的基因，而XCI似乎對Xq28重復(fù)女性中的MECP2表達(dá)至關(guān)重要。

結(jié)論：

本文中作者檢測了兩例無癥狀女性（母親和祖母）間質(zhì)性Xq28重復(fù)。AR（androgen receptor）和RP2（retinitis pigmentosa 2）分析表明，兩者的XCI都極為傾斜，Xq28重復(fù)染色體在母親體內(nèi)失活，但在祖母體內(nèi)被意外激活。有趣的是，通過結(jié)合RNA測序和全外顯子組測序，作者證實(shí)XIST僅在兩名女性的Xq28重復(fù)染色體中表達(dá)，表明Xq28重復(fù)染色體不活躍。同時，排除這兩名女性，尤其是祖母的主要臨床表型，重復(fù)X染色體中的MECP2和大多數(shù)XCI基因沒有轉(zhuǎn)錄表達(dá)或上調(diào)。作者發(fā)現(xiàn)，使用RNA測序檢測的XCI狀態(tài)與建立女性MECP2復(fù)制的臨床表型更相關(guān)。這表明，除了DNA甲基化之外，還有其他因素維持XCI狀態(tài)，一種可能的額外抑制機(jī)制發(fā)生在非甲基化X染色體的轉(zhuǎn)錄水平，抵消了MECP2復(fù)制的有害表型效應(yīng)。

英文題目：Lack of MECP2 gene transcription on the duplicated alleles of two related asymptomatic females with Xq28 duplications and opposite X‐chromosome inactivation skewing.

中文題目：轉(zhuǎn)錄組+外顯子揭示Xq28重復(fù)綜合征女性患者無臨床癥狀的原因

期刊：Human Mutation

IF：4.878

發(fā)表時間：2021.7.14

作者：Yixi Sun

材料與方法：

材料：具有典型的MECP2重復(fù)綜合征癥狀男孩患者（III.2）、其母親（II.2）、父親（II.1）、外祖母（I.2）、外祖父（I.1）；
Keywords：RNA-seq；WEX；SNP微陣列；

實(shí)驗結(jié)果

一、通過SNP陣列、qRT-PCR和FISH分析，在女性II.2和I.2中發(fā)現(xiàn)Xq28染色體內(nèi)重復(fù)

使用SNP微陣列檢測I.1、I.2和II.2的變化。在II.2和I.2（圖1b）中，在Xq28區(qū)域和Xq27.3區(qū)域分別顯示了437KB的重復(fù)和284KB的重復(fù)，這表明Xq28和Xq27.3重復(fù)是母系遺傳的。Xq28區(qū)域包含13個在線孟德爾人遺傳（OMIM）基因（包括MECP2、IRAK1、L1CAM、NAA10和HCFC1）。通過qRT-PCR以驗證結(jié)果，在男性I.1中檢測到MECP2和IRAK1一個基因劑量的拷貝，而在正常對照女性中檢測到兩個拷貝，在I.2和II.2中檢測到三個拷貝（圖1c，d）。對女性I.2和II.2的中期染色體進(jìn)行FISH分析，發(fā)現(xiàn)含有MECP2的探針RP11-119A22僅在Xq28處有信號，這表明Xq28重復(fù)是串聯(lián)的，沒有整合到基因組的其他地方（圖1e，f）。

圖1

二、AR和RP2分析表明，女性I.2和II.2具有極度傾斜的XCI

作者進(jìn)行了基于PCR的AR和RP2分析，以評估外周血中的XCI模式。使用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶HpaII，使PCR只擴(kuò)增非活性X染色體上的等位基因。通過分離分析確定了失活X染色體的起源。

II.2的未消化PCR產(chǎn)物給出了每個標(biāo)記的兩個峰（AR為267/287，RP2為359/381）。HPAII消化產(chǎn)物（圖2c和2f）觀察到一個代表287個AR（359個RP2）的主峰，這表明失活等位基因遺傳自I.2。對I.2的未消化PCR產(chǎn)物的分析給出了兩個峰（AR為281/287，RP2為359/374）。通過分析HpaII消化產(chǎn)物（圖2b和2e）檢測到的主峰（AR為281，RP2為374）與II.2失活產(chǎn)物等位基因中的主峰不同。這些結(jié)果表明，在母親II.2和祖母I.2中發(fā)現(xiàn)了XCI的極端傾斜，這與失活X染色體不同（圖2）。AR PCR產(chǎn)物的287 bp峰值、II.2中RP2 PCR產(chǎn)物的359 bp峰值以及Xq28重復(fù)來自祖母I.2，它們與相同的X染色體相連。然而，該等位基因在AR PCR后峰值為287 bp，RP2 PCR后峰值為359 bp，Xq28重復(fù)，在II.2中失活，但在I.2中激活。

圖2

三、使用外顯子組測序在I.2中未檢測到X染色體上沒有Xq28重復(fù)的其他潛在致病性變體

根據(jù)AR和RP2分析的結(jié)果，I.2中的MECP2重復(fù)應(yīng)該位于活躍的X染色體上。如果兩條X染色體都有缺陷，則具有更有害變體的突變X染色體將完全失活，以避免其不良反應(yīng)，迫使另一條變得活躍。因此，對于I.2，假設(shè)在沒有Xq28重復(fù)的X染色體上存在額外的更有害的致病性變體，從而迫使Xq28重復(fù)變得活躍。

微陣列結(jié)果中顯示，除了Xq28和Xq27.3重復(fù)外，在I.2和II.2中未發(fā)現(xiàn)致病性拷貝數(shù)變異。為了進(jìn)一步探索其他變體，作者對女性I.2和II.2的DNA進(jìn)行外顯子組測序，在I.2和II.2中篩選了X染色體上OMIM基因的不同變體，特別是在I.2中沒有Xq28重復(fù)的X染色體上的變異。結(jié)果顯示，X染色體上有12個變異，包括一個無義變體和11個錯義變體。只有三個基因（NR0B1、DMD和USP9X）與疾病有關(guān)，根據(jù)ACMG指南，所有變異均不符合“致病性”或“可能致病性”的分類（Richards等人，2015）。沒有證據(jù)表明這些變體比Xq28復(fù)制品更有害?？傊贗.2中未發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致繼發(fā)性傾斜的其他潛在致病性變體。

四、對于II.2和I.2，XIST中的雜合SNP 僅在具有Xq28重復(fù)的X染色體中表達(dá)，這表明Xq28重復(fù)染色體不活躍

為了確定可能導(dǎo)致I.2原發(fā)性傾斜的原因，作者對外周血單個核細(xì)胞（PMBC）進(jìn)行了RNA測序；通過外顯子組測序，作者在I.2和II.2的XIST區(qū)域附近鑒定了8個SNP。對于I.2和II.2，沒有發(fā)現(xiàn)XIST的所有SNPs存在差異，也沒有證據(jù)表明這些變體會影響XCI的初始過程。在I.2中，沒有Xq28重復(fù)的X染色體上沒有假定的主要傾斜原因。

作者還使用基于配對RNA-seq和DNA-seq數(shù)據(jù)的XIST酶的度量來量化XCI的傾斜程度。結(jié)果表明，rs144237473（NC_000023.11:g.73846325）（g:0/A:288）的雜合等位基因在II.2的純合條件下表達(dá)，這是母體遺傳。類似地，I.2中rs144237473（G:0/A:291）的等位基因表達(dá)極度傾斜。作者還通過Sanger測序驗證了DNA和cDNA中的SNP（圖3a）。對于I.2和II.2，在rs144237473（NC_000023.11:G.73846325）位置檢測到G/A變體，但在cDNA水平上僅檢測到從I.2遺傳的帶有“A”的等位基因。XIST作為一種X-非活性特異轉(zhuǎn)錄本，僅在非活性X-染色體上表達(dá)。II.2的Xq28重復(fù)染色體也遺傳自I.2。結(jié)果顯示，每一位女性的非活動X染色體都是與Xq28重復(fù)相同的染色體。

圖3

五、RNA測序顯示兩名女性的Xq28重復(fù)等位基因上的MECP2和IRAK1沒有轉(zhuǎn)錄表達(dá)

X連鎖基因的XCI狀態(tài)被定義為逃逸、可變逃逸和失活。XCI基因，如MECP2和IRAK1，僅在活躍的X染色體上表達(dá)。II.2和I.2中XCI基因（MECP2、IRAK1、TMEM187和TKTL1）的所有SNP表達(dá)均處于純合狀態(tài)，表明II.2和I.2中的XCI極為傾斜。在Xq28重復(fù)區(qū)域中，有幾個信息可以確定親本來源的單核苷酸多態(tài)性，如MECP2（NC_000023.11:g.154030040）、IRAK1（NC_000023.11:g.154013378等。結(jié)果表明，從祖母I.2遺傳的等位基因（具有Xq28重復(fù)）沒有轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同樣，在可變的XCI基因HCFC1、NAA10和逃逸的XCI基因RENBP中，母親從I.2遺傳的重復(fù)等位基因表達(dá)較低。圖4 中顯示的XCI基因的信息性SNP，發(fā)現(xiàn)XCI基因MECP2和IRAK1在Xq28II.2和I.2的重復(fù)等位基因在轉(zhuǎn)錄中沉默。

圖4

圖5

通過PMBCs中的RNA-seq，作者比較了兩名MECP2重復(fù)的女性和兩名年齡匹配的對照女性之間的差異表達(dá)。然后重點(diǎn)研究了跨基因的基因轉(zhuǎn)錄Xq28——II.2和I.2中的重復(fù)區(qū)域；MECP2和IRAK1基因的表達(dá)劑量在II.2和I.2之間無顯著差異。另外，還通過RT-qPCR檢測了具有Xq28重復(fù)的家族成員和年齡匹配的正常人中MECP2和IRAK1的mRNA（圖5）。與年齡匹配的男性對照組相比，III.1中MECP2和IRAK1的表達(dá)劑量顯著升高（平均分別為4.6倍和5.2倍），而與年齡匹配的女性對照組相比，Xq28復(fù)制女性I.1和II.1中的劑量沒有顯著上調(diào)。

總結(jié)

作者通過對Xq28重復(fù)（涉及MECP2）女性（母親和祖母）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和全外顯子測序。僅從AR和RP2分析判斷，I.2應(yīng)該有相關(guān)的臨床表型，并且MECP2基因表達(dá)上調(diào)，但I(xiàn).2是無癥狀攜帶者。作為59歲的女性，I.2可能發(fā)生與年齡相關(guān)的XCI傾斜。通過AR分析，在55-60歲以上人群的橫斷面研究中，XCI的傾斜度隨著年齡的增長而顯著增加，但有趣的是，Swierczek等人通過一種新的XCI分析轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)老年女性的傾斜度沒有增加。甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平檢測到的XCI狀態(tài)不一致。

作者的結(jié)果相似，通過結(jié)合RNA-seq和RT-PCR，發(fā)現(xiàn)在非活性X染色體上特異表達(dá)的X-非活性特異轉(zhuǎn)錄物XIST僅在I.2和II.2的Xq28重復(fù)染色體上表達(dá)。這表明Xq28重復(fù)染色體是不活躍的。另外還發(fā)現(xiàn)，兩個女性的Xq28重復(fù)等位基因上的MECP2和IRAK1（受XCI影響的基因）沒有轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這解釋了為什么這兩名女性，特別是I.2，是無癥狀攜帶者。同時，作者推測，除了DNA甲基化之外，其他因素也在維持XCI狀態(tài)，一種額外的抑制機(jī)制可能發(fā)生在非甲基化X染色體的轉(zhuǎn)錄水平，以抵消MECP2復(fù)制的有害表型效應(yīng)。根據(jù)XCI，作者的發(fā)現(xiàn)為MECP2重復(fù)綜合征知識及其在女性中的表型后果增加了新的見解，這對遺傳和產(chǎn)前咨詢具有重要意義。

原文鏈接：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34273908

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