榕樹是熱帶和亞熱帶植物，他們的氣生根沿著寄主樹木的樹干下降到土壤中，使許多榕樹物種能夠像半附生植物一樣生活。細葉榕（Ficus microcarpa）、對葉榕（Ficus hispida）分別代表了兩種不同的生長形式：雌性同株/半附生和雌雄異株/非附生。不同的榕樹與其傳粉蜂形成了專性互利共生關(guān)系。高質(zhì)量基因組為研究氣生根基因、雌性同株和雌雄異株以及共生系統(tǒng)中的共分化提供了深入的見解和基因組資源。

 

 

作者首先完成細葉榕、對葉榕及細葉榕傳粉小蜂基因組組裝注釋

（1）細葉榕使用~84X PacBio RSⅡ（36.87?Gb）完成426Mb 基因組組裝（預(yù)估436 Mb，97.7%），contigN50=908 Kb， BUSCO評估為95.6%；并通過ALLHiC將423 Mb基因組掛載至13條染色體上。注釋29,416個蛋白編碼基因（BUSCO評估為94.4%）

（2）對葉榕使用~97X PacBio RSⅡ（36.12 Gb），最終組裝360 Mb基因組（預(yù)估370Mb 97.3%），contigN50= 492 kb，BUSCO評估為97.4%；并通過ALLHiC將 359 Mb基因組掛載至14條染色體上，與高密度遺傳圖譜具有高度一致性。注釋27,211個蛋白編碼基因（BUSCO評估為95.7%）

（3）K-mer評估顯示榕小蜂（Eupristina verticillata）具有較高雜合（1.1%），使用~170X PacBio（65 Gb）進行基因組組裝，通過去冗余后最終組裝387 Mb 基因組（預(yù)估 382 Mb）， contig N50=3.1 Mb，BUSCO評估為97.7%。經(jīng)過從頭預(yù)測、同源預(yù)測及轉(zhuǎn)錄組預(yù)測，最終注釋14,312個蛋白編碼基因（表1）。

將細葉榕的傳粉小蜂E. verticillata與對葉榕的傳粉小蜂Ceratosolen solmsi基因組比對發(fā)現(xiàn)兩者的分化時間~41.5 Mya，與細葉榕和對葉榕的預(yù)估分化時間非常相近（~40 Mya）。

 

表1 細葉榕、對葉榕及榕小蜂基因組組裝及評估結(jié)果

 

兩種榕樹基因組比較發(fā)現(xiàn)有大量結(jié)構(gòu)變異，細葉榕的3號染色體FmChr03，與對葉榕3號及7號染色體（FhChr03、FhChr07）發(fā)生融合或裂變事件，重排區(qū)內(nèi)的基因富集顯示主要與植物免疫功能有關(guān)。兩種榕樹在真雙子葉植物的三倍體事件之后，均沒有檢測到全基因組復(fù)制（WGD）事件。全基因組比對分析表明，兩個榕樹基因組共有約38Mb 片段重復(fù)（SDs），表明SD是基因組規(guī)模擴大的主要因素。

 

圖1 對葉榕與細葉榕基因組特征圈圖

 

細葉榕與對葉榕顯著差異表現(xiàn)為前者有氣生根而后者沒有，為了尋找觸發(fā)氣生根的途徑，作者在氣生根尖鑒定到811個高表達基因。這些高表達的基因在一系列與運輸相關(guān)的生物過程中顯著富集。通過對PIN家族的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)PIN1基因存在顯著的拷貝數(shù)變異（CNV），并確定了兩個進化的PIN1亞群。第一組（PIN1a）在兩種榕樹和擬南芥中均被鑒定到，第二組（PIN1b）僅于兩種榕樹中。RNA-seq表明，FmPIN1a在大多數(shù)被測組織中均有表達，而FmPIN1b1、FmPIN1b2和FmPIN1b3在氣生根樣品中高表達。光受體CRY2和PHR2的拷貝數(shù)增加，TAR（如TAT2a、TAT2b和TAT7b）和YUC編碼基因（如YUC6）的表達增加進一步加速了IAA的積累，與對葉榕相比，細葉榕氣生根尖的內(nèi)源生長素濃度高出5倍。說明生長素的增加引發(fā)了氣生根的發(fā)育，光促進的生長素依賴途徑與氣生根的發(fā)生、生長和形態(tài)形成有關(guān)。

 

圖2 細葉榕氣生根發(fā)育的遺傳基礎(chǔ)

 

為了研究對葉榕的性染色體進化與性別決定基因，作者構(gòu)建了超高密度遺傳圖譜。在Chr12中，起始~2?Mb區(qū)的一個非重組區(qū)被鑒定為性別決定區(qū)（SDR），并在該區(qū)域高置信度地注釋了一個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子（Fh.12g000020）。12號染色體上一個不重組的性共分離區(qū)的鑒定表明，雌雄異株的對葉榕已經(jīng)進化出一對初生的性染色體。

此外，作者新開發(fā)了染色體定相方法并重新組裝了X和Y染色體。X染色體和Y染色體中分別為21.9 Mb和22.6 Mb，表明Y染色體已經(jīng)擴展了700 kb（圖3C）。比較X和Y染色體，結(jié)合存在或缺失變異（PAV）分析及RNA-seq分析以及重測序比對，顯示蛋白編碼基因（Fh.12g000020）基因只存在于雄性基因組中，而不存在于雌性基因組中，是影響性別決定的主要因素（圖3E）。

花發(fā)育C類基因AG在雌雄異株的對葉榕中有兩次重復(fù)，而在雌雄同株的細葉榕中沒有重復(fù)。FhAG2定位于SDR，無X等位基因，具有雄性特異性，是性別決定的有力候選基因。并且AG旁系同源基因在其他三種雌雄異株物種中，僅在雄性基因組內(nèi)存在。

 

圖3 對葉榕Y染色體及性別決定基因鑒定?

 

利用112份榕樹材料的基因組重測序數(shù)據(jù)，建立了榕樹的系統(tǒng)發(fā)育史，其中包括62種榕樹屬，包括2個雌雄同株亞屬（Pharmacosycea, Urostigma）和4個雌雄異株亞屬（Sycidium,Sycomorus, Synoecia?,Ficus），它們代表了榕樹的6個亞屬和主要分支。白肉榕亞屬（Pharmacosycea）被分至兩類，進化樹、ADMIXTURE、遺傳相關(guān)性分析及ABBA-BABA分析發(fā)現(xiàn)了整個屬存在潛在廣泛的種間雜交。系統(tǒng)發(fā)育揭示了雌雄同株代表了整個屬的祖先繁殖系統(tǒng)（圖4）。分化時間顯示，始新世時期（約47.5 Mya）出現(xiàn)了雌雄同株和雌雄異株的分化。

 

圖4 榕樹進化史

 

七千五百萬年來，榕樹和榕小蜂之間的專性協(xié)同進化在這個協(xié)同進化系統(tǒng)中形成了形態(tài)和生理上的相適應(yīng)。榕樹在全球和當(dāng)?shù)囟加袠O高的物種多樣性，同域近緣榕果物種間生殖隔離的主要原因是傳粉蜂的特異性。為了探討榕果與傳粉蜂協(xié)同進化的潛在分子機制，作者利用14個來自Sycomorus亞屬的榕樹和其相應(yīng)傳粉蜂的重測序數(shù)據(jù)進行分析。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，在這個分類水平上，寄主關(guān)聯(lián)具有很強的保守性，同時也檢測到一些寄主轉(zhuǎn)移事件。為了確定在這些協(xié)同進化的物種中可能經(jīng)歷了相互選擇和分化的候選基因，作者利用Tajima’D和SweeD分析對榕果和傳粉蜂基因組進行了選擇性清除分析，顯示在榕果和傳粉蜂中生長相關(guān)的基因、榕果揮發(fā)物相關(guān)基因和傳粉蜂化學(xué)感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因受到一定的選擇作用。并通過榕小蜂對三種不同榕果釋放揮發(fā)物質(zhì)的電生理測試，支持了甲羥戊酸和莽草酸途徑在吸引特定傳粉者方面的重要作用（圖5），揭示了在這種專性互利共生中共分化的潛在分子機制。

 

圖5 共進化和與形態(tài)學(xué)有關(guān)的基因的群體研究

 

團隊介紹

福建農(nóng)林大學(xué)基因組與生物技術(shù)研究中心成立于2013年，由教育部“長江學(xué)者”明瑞光教授擔(dān)任首席科學(xué)家及中心主任，主要以甘蔗、木瓜和菠蘿等熱帶、亞熱帶作物以及區(qū)域特色作物作為研究對象。成立短短幾年來，已在《Cell》、《Nature Genetics》、《Genome Research》、《Genome Biology》、《The Plant Journal》等刊物發(fā)表系列高水平文章，培育了大批高水平生物學(xué)人才。明瑞光教授為本文通訊作者。

中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶森林生態(tài)學(xué)重點實驗室動植物關(guān)系研究組（EEPAI）建立于2002年，由中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園主任、中國植物園聯(lián)盟理事長陳進研究員擔(dān)任研究組組長，試圖用野外生態(tài)學(xué)、分子生態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等多學(xué)科研究手段，研究動植物相互關(guān)系對生態(tài)系統(tǒng)的影響及其在進化上的意義，幾年間已在動植物相互關(guān)系及協(xié)同進化、生態(tài)學(xué)及環(huán)境教育等領(lǐng)域發(fā)表系列高水平文章。陳進研究員為本文共同通訊作者。

本文第一作者張興坦副教授，碩士生導(dǎo)師。2015年7月進入福建農(nóng)林大學(xué)基因組與生物技術(shù)研究中心工作。主持國家自然科學(xué)基金1項，福建省基金1項。近年來以第一作者或共同第一作者在Cell，Nature，Nature Genetics， Nature Plants，Plant Biotechnology Journal等國際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表SCI論文多篇。

本文第一作者王剛副研究員。2013年進入中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園工作；承擔(dān)科研項目情況：中國科學(xué)院人才項目,中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進會會員；國家自然科學(xué)基金面上項目；國家自然科學(xué)青年基金項目等。

 

百邁客Hi-C優(yōu)勢

自2016年初以來，百邁客利用Hi-C技術(shù)進行染色體水平的基因組組裝及染色體三維構(gòu)象的研究，成功開發(fā)出六堿基、四堿基酶切方案，組裝、互作輕松拿下。截至2020年9月，百邁客Hi-C完成300多個物種，文庫數(shù)量已經(jīng)近2000個，文庫含酶切位點的有效數(shù)據(jù)比例高達93%以上。自2018年5月高質(zhì)量亞洲棉基因組文章見刊起，百邁客Hi-C項目成功案例相繼見刊勢如破竹。短短2年間，成功案例已突破40余篇，更是有超過5篇合作案例刊登于雜志Nature Genetics，其中不乏二倍體、同源多倍體、異源多倍體等復(fù)雜且高質(zhì)量基因組的獲得，高階文章的連續(xù)發(fā)表印證了百邁客Hi-C技術(shù)在科研領(lǐng)域中的優(yōu)勢。

 

參考文獻：

[1] Zhang J, Zhang X et al.,Allele-defined genome of theautopolyploid sugarcane Saccharum spontaneum?L.Nature Genetics.2018.

[2]Chen L ,VanBuren R, Paris M et al.,The bracteatus pineapple genome and domestication of clonally propagated crops. Nature genetics.2019.