研究背景

在人腦中，與精神分裂癥相關(guān)的基因組區(qū)域富集了在神經(jīng)發(fā)育過程中表現(xiàn)出不同異構(gòu)體使用的基因，RNA剪接是將遺傳變異與精神疾病聯(lián)系起來的關(guān)鍵機(jī)制。剪接圖譜在大腦中特別多樣，很難準(zhǔn)確識別和量化。短讀長RNA-Seq方法不能準(zhǔn)確地重建和定量大多數(shù)轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)異構(gòu)體，為解決這一挑戰(zhàn)，本文將long-range PCR和nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序與一種新的生信分析流程結(jié)合。

CACNA1C是一種精神危險基因，編碼電壓門控鈣通道CaV1.2，CACNA1C基因很大而且很復(fù)雜，至少有50個注釋外顯子和31個預(yù)測的轉(zhuǎn)錄本。它的大小和復(fù)雜性使得用標(biāo)準(zhǔn)的基因表達(dá)方法準(zhǔn)確鑒定和量化轉(zhuǎn)錄本變得極其困難，本文在人腦中鑒定了CACNA1C的全長編碼轉(zhuǎn)錄本，識別了38個新的外顯子和241個新的轉(zhuǎn)錄本，對異構(gòu)體多樣性的詳細(xì)了解對于將精神病學(xué)基因組發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為病理生理學(xué)見解和新的精神藥理靶點(diǎn)至關(guān)重要。

研究方法

樣本：來自利伯腦發(fā)育研究所儲存庫的三名成年捐贈者的尸檢腦組織（提取小腦、紋狀體、背外側(cè)前額葉皮質(zhì)、扣帶回、枕葉和頂葉皮質(zhì)的RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄）
測序方法：使用PCR擴(kuò)增CACNA1C全長CDS，使用MinION進(jìn)行測序
分析流程：https：//github.com/twrze/TAQLoRe

研究結(jié)果

1、CACNA1C有很多外顯子和異構(gòu)體

由于CACNA1C的復(fù)雜性，本文使用了兩種互補(bǔ)的方法來鑒定轉(zhuǎn)錄本：外顯子水平和剪接位點(diǎn)水平的分析，分析流程見補(bǔ)充圖2。該方法共鑒定了251種存在于人腦中獨(dú)特的CACNA1C轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，其中241種是新的，包括使用新的外顯子，新的剪接位點(diǎn)和連接。

補(bǔ)充圖2

在CACNA1C基因座內(nèi)總共注釋了39個潛在的新外顯子，其中38個在至少2個人或組織中被識別，并在每個文庫中得到至少5條nanopore reads的支持（圖2A）。通過PCR和Sanger測序確認(rèn)了新的外顯子與其周圍的注釋外顯子之間的剪接連接，從而驗(yàn)證了四個新的外顯子。這種新的外顯子的成功驗(yàn)證提供了很高的可信度，即通過納米孔測序鑒定的新的外顯子是真實(shí)的，并且被整合到CACNA1C轉(zhuǎn)錄本中。表達(dá)量最高的10條轉(zhuǎn)錄本中，有9條是新的且其中有8條被預(yù)測保持CACNA1C閱讀框架，這表明這些最豐富的新轉(zhuǎn)錄本中有一些編碼功能不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體（圖2B,C）。這些結(jié)果表明，新的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐富，數(shù)量也很多，目前的注釋缺少許多最豐富的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本。

圖2

通過設(shè)置轉(zhuǎn)錄本的高置信度，在6個大腦區(qū)域確定了90個高可信的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本，包括7個先前注釋的(GENCODE V27)和83個新的(補(bǔ)充圖3)。7個新的高置信度轉(zhuǎn)錄本包含新的外顯子，而其余76個包含以前未描述的連接和連接組合。

補(bǔ)充圖3

上述外顯子水平的轉(zhuǎn)錄本鑒定方法為鑒定新的外顯子和表征全長轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)提供了穩(wěn)健和保守的手段。使用了更為保守的依賴于連接處無錯誤映射所支持的連接的識別，以及規(guī)范剪接位點(diǎn)的方法，確定了497個新的剪接位點(diǎn)，其中393個由至少10條reads支持，這些剪接位點(diǎn)，在篩選了至少24條reads支持的轉(zhuǎn)錄本后，鑒定了195個轉(zhuǎn)錄本，其中111個被預(yù)測為編碼的。

2、CACNA1C亞型在不同腦區(qū)的表達(dá)譜不同

小腦、紋狀體與皮質(zhì)等組織觀察到了CACNA1C轉(zhuǎn)錄本差異，但在不同個體之間的表達(dá)是相似的。在小腦中觀察到了明顯的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)轉(zhuǎn)換；在小腦之外，ENST00000399641是主要的轉(zhuǎn)錄本，而在小腦中，ENST00000399641和CACNA1C n2199的表達(dá)水平相似。

圖3 C

3、預(yù)測新isoforms對CaV1.2蛋白模型的影響

CACNA1C編碼CaV1.2 的主要成孔亞基。鈣孔由24個跨膜重復(fù)序列組成，由細(xì)胞內(nèi)環(huán)連接成4個結(jié)構(gòu)域(I-IV)(圖4A)。在我們鑒定的83個新的外顯子水平的轉(zhuǎn)錄本中，51個可能編碼功能性的CaV1.2通道。灰色方框表示新的、框架內(nèi)的插入和刪除的位置（值表示包含每個isoforms的reads的平均比例）。使用兩種分析方法（外顯子水平和剪切連接水平）鑒定變體的情況，外顯子水平計(jì)數(shù)用于得出豐度(紅色文本)；僅使用剪接位點(diǎn)水平方法鑒定的變體用藍(lán)色文本表示。包含三個微缺失的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的數(shù)量：(I)在I-II接頭中，(Ii)在IV4-5接頭中，以及(Iii)在IV3-4接頭中先前報道的微缺失(圖4B)。

圖4

總結(jié)

長讀長測序技術(shù)的快速發(fā)展為準(zhǔn)確獲得轉(zhuǎn)錄多樣性提供了可能，因?yàn)槊恳粭lread都包含一個完整的轉(zhuǎn)錄本。這對于具有復(fù)雜模型的基因尤其重要。由于CACNA1C剪接產(chǎn)生的CaV1.2蛋白對現(xiàn)有的鈣通道阻滯劑表現(xiàn)出不同的敏感性，因此有可能選擇性地針對疾病相關(guān)的CACNA1C亞型和/或那些在大腦與外周差異表達(dá)的CACNA1C亞型，提供既更有效又更無外周副作用的新型精神藥物。綜上，這些觀察結(jié)果證明了ONT長讀長測序?qū)τ跍?zhǔn)確描述轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)和選擇性剪接的重要性。

參考文獻(xiàn)：
Clark Michael B,Wrzesinski Tomasz,Garcia Aintzane B et al. Long-read sequencing reveals the complex splicing profile of the psychiatric risk gene CACNA1C in human brain.[J] .Mol. Psychiatry, 2020, 25: 37-47.

圖1 開心果基因組進(jìn)化

2.?開心果應(yīng)激適應(yīng)相關(guān)的擴(kuò)張基因家族

為了揭示開心果表型（如耐鹽性）的遺傳基礎(chǔ)，利用OrthoMCL通過識別不同植物之間獨(dú)特和共同的基因家族來研究基因家族的進(jìn)化。開心果與擬南芥、柑橘、雷蒙德氏棉、葡萄相比有9735個共有基因家族，而含有1381個基因的707個開心果有特基因家族。對這些基因進(jìn)行GO與KEGG富集分析，并都發(fā)現(xiàn)了許多與“防御反應(yīng)”有關(guān)的基因，其中包括許多包含NB-ARC domain和NBS-LRR domain的基因。這種基因以植物抗病性著稱，對開心果的防御反應(yīng)具有相當(dāng)重要的意義。

接下來，作者研究了開心果基因家族的擴(kuò)張和收縮（圖1c）。由于很難從基因家族規(guī)模的收縮或與未在該參考基因組中成功組裝的基因有關(guān)，這里只分析了擴(kuò)展的基因家族。對擴(kuò)展基因家族的基因富集分析發(fā)現(xiàn)，它們在代謝類別中豐富，如萜類、黃酮類、倍半萜類和生物堿的生物合成。基因家族的擴(kuò)展發(fā)生在長期進(jìn)化之后，并推動了黃連木屬和柑橘屬之間的進(jìn)化差異，而不是開心果從野外馴化的非常短期的進(jìn)化。因此，我們認(rèn)為上述基因的擴(kuò)展可能與野生黃連木中有機(jī)化合物的代謝有關(guān)。野生黃連木的植物化學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)了許多植物化學(xué)物質(zhì)，如生物堿、黃酮、香豆素、甾醇、單寧、萜類和倍半萜類。

此外，豐富的術(shù)語“氧化還原過程”包含許多細(xì)胞色素P450基因，這些基因編碼參與多種功能復(fù)雜代謝途徑的蛋白質(zhì)，并在多個過程中發(fā)揮重要作用，特別是在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用。在187個細(xì)胞色素P450基因中，我們發(fā)現(xiàn)許多可能具有耐鹽功能。例如，透水性研究發(fā)現(xiàn)，CYP94家族基因表達(dá)水平的升高可減輕水稻的茉莉酸反應(yīng)，增強(qiáng)水稻的耐鹽性。在開心果的這些擴(kuò)張基因家族中，有14個CYP94基因。大豆中，CYP82A3參與茉莉酸和乙烯信號通路，增強(qiáng)對鹽堿和干旱的抗性，開心果擴(kuò)張基因家族中有20個CYP82基因成員。毛果楊CYP714A3的異位表達(dá)增強(qiáng)了水稻的耐鹽性，開心果擴(kuò)張基因家族中有10個CYP714A基因。因此，一些細(xì)胞色素P450基因可能與開心果的耐鹽性有關(guān)。

3.?RNA-seq揭示了開心果鹽適應(yīng)的遺傳機(jī)制

進(jìn)一步研究開心果的耐鹽性潛在遺傳機(jī)制，研究者進(jìn)行了鹽度實(shí)驗(yàn)。開心果砧木（P.vera?L.cv.Ohadi）的葉和根在正常條件和鹽度條件下進(jìn)行RNA測序。使用Tophat-Cufflinks-Cuffdiff?pipeline，在鹽水條件下處理的植物與對照之間表現(xiàn)出差異表達(dá)，鑒定214和461蛋白質(zhì)編碼基因分別在葉和根組織中（ncontrol = 3, nsalinity = 3, corrected P < 0.05,）?；蚋患治霭l(fā)現(xiàn)許多差異表達(dá)基因（31個基因）參與到“氧化還原進(jìn)程”中（圖2a，b）。像比較基因組分析一樣，該類別中的15個基因是細(xì)胞色素P450基因，特別是CYP74A（即AOS），其編碼細(xì)胞色素P450 CYP74基因家族的一個成員，其起到丙二烯氧化物合酶（AOS）的作用。這種酶催化茉莉酸酯合成中的第一步[即茉莉酸（JA）]。AOS中每千堿基外顯子的表達(dá)片段（FPKM）值在葉片中從對照中的近0增加到鹽水條件下的2163.75，在根中從對照中的1.87增加到鹽水處理的87.74。研究者還發(fā)現(xiàn)了7個差異表達(dá)的基因(ChiC, TT4, ILL6, MYB108, MYB6, PRB1, and TIFY5A)被富集到“茉莉酸反應(yīng)”中。以前的研究表明，干旱和高鹽度導(dǎo)致水稻葉片和根部JA含量增加。鹽度處理可以增加濕地物種鳶尾（Iris hexagona）中的內(nèi)源JA水平。茉莉酸酯激活植物對生物脅迫（即病原體攻擊）和非生物脅迫（即鹽）的反應(yīng)。在此，用鹽水處理增加了在葉和根中參與茉莉酸反應(yīng)的這些基因的表達(dá)水平（圖2c）。這些基因的表達(dá)增加（例如，AOS作為酶催化茉莉酸酯合成中的第一步）應(yīng)該增加茉莉酮酸酯的合成，因此，它們很可能被開心果用于應(yīng)對鹽脅迫。

差異表達(dá)的基因富集到“幾丁質(zhì)結(jié)合”，其中四種基因編碼幾丁質(zhì)酶(CHIB, EP3, ChiC, AT2G43590)。植物幾丁質(zhì)酶涉及多種生物系統(tǒng)。植物中的一些幾丁質(zhì)酶是針對環(huán)境脅迫（如高鹽濃度，寒冷和干旱）而表達(dá)的，并且可以通過植物激素如乙烯，茉莉酸和水楊酸來上調(diào)。例如，基因ChiC編碼V類幾丁質(zhì)酶，其表達(dá)可由茉莉酸和擬南芥鹽度引起的脅迫來誘導(dǎo)。研究者的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，編碼幾丁質(zhì)酶的基因和參與JA生物合成途徑的基因可能有助于開心果適應(yīng)鹽水環(huán)境。

?圖2 鹽處理下開心果的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

4.?不同野生種間混和

為了研究開心果的種群歷史和適應(yīng)性進(jìn)化，研究者對107個開心果基因組進(jìn)行重測序，包括93個品種和14個野生開心果，平均測序深度為6-8X。作者還重新測序了來自不同近緣種的35個基因組，包括P.mutica，P.khinjuk，P.integerrima和P. palaestina。用stringent GATK pipeline，發(fā)現(xiàn)14.77百萬個單基因變異位點(diǎn)，其中2.42百萬個在基因區(qū)。使用鄰近法和最大似然法的系統(tǒng)發(fā)育分析清楚地分離了5種不同的種群，即?P.vera, P.mutica, P. khinjuk, P. integerrima, and P. palaestina。通過TreeMix程序在一些物種之間檢測到漸滲的信號，這表明雜交可能在自然界中的不同近親之間發(fā)生，并且與植物中被發(fā)現(xiàn)的普遍雜交一致。然而，從其他開心果物種到馴化的開心果沒有檢測到漸滲，這種現(xiàn)象來源于野生的P. vera（圖3）。

?圖3 不同野生種間的基因漸滲

5.?開心果兩步馴化歷程

基于重測序數(shù)據(jù)，研究人員推測了這些物種的有效群體大小的變化，并發(fā)現(xiàn)在 Pleistocene期間發(fā)生了瓶頸事件，且在 ~200 kyr前，有效群體大小增加。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示馴化和野生開心果之間的分離（圖4a）。利用δaδi推算野生和馴化開心果的分化時間在 ~8000年前，這與早在公元前6750年就表明開心果種子是一種常見的食物這一考古記錄相似。為了深入了解開心果種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系，研究人員進(jìn)行了兩項(xiàng)經(jīng)典分析：群體結(jié)構(gòu)和主成分分析（圖4b，c）。這些分析清晰的顯示栽培種質(zhì)分為兩個群。栽培種Group I的LD最高，栽培種Group II和野生開心果的LD衰減值相近。Group II包括 Qazvini，Italiaei和Badami

Zarand在內(nèi)的5種類型的個體，且這些種質(zhì)被記錄為古代具有種子的材料（圖4d）。與系統(tǒng)發(fā)育樹一致，這三個品種含有較高比例的野生血統(tǒng)（圖4e）,這些結(jié)果支持了其兩步馴化的過程，初步馴化，然后通過作物育種進(jìn)行改良。

圖4 野生和馴化開心果的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

6.?開心果馴化的遺傳機(jī)制

群體核苷酸多態(tài)性θπ分析揭示了馴化型種質(zhì)的核苷酸多態(tài)性低于野生型種質(zhì)，通過分析發(fā)現(xiàn)，栽培種質(zhì)中基因組上的一些區(qū)域的多態(tài)性降低，這些區(qū)域可能含有受到人工選擇的基因。此外，研究人員鑒定了栽培型和野生型樣品分化水平增加的區(qū)域。在馴化和野生的開心果之間，在基因組上約有9.2 Mb的區(qū)域被鑒定為具有高水平的群體分化。栽培種間遺傳多樣性降低，且超過95%的閾值。遺傳多樣性減少的區(qū)域和群體分化增強(qiáng)的區(qū)域在馴化或育種過程中經(jīng)歷了選擇性清除。共計(jì)有665個基因定位在該區(qū)域。研究人員定位了受正向選擇的候選基因，其可能與馴化過程中重要的表型進(jìn)化相關(guān)。在開心果馴化的過程中，其樹形大小經(jīng)歷了人工選擇（圖5a）。研究人員發(fā)現(xiàn)了基因SAUR55（圖5b），編碼生長素應(yīng)激蛋白，在植物的生長過程中發(fā)揮重要的作用，其在開心果的人工選擇下進(jìn)化而來。除此之外，基于也和根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，馴化種與野生種相比，基因SAUR55表現(xiàn)出了顯著增加的表達(dá)水平（圖5c）。這些結(jié)果與在其它作物（如水稻和小麥）中生長素應(yīng)激性基因的選擇性清除的研究結(jié)果一致，并揭示了在作物馴化期間類似特征性狀的人工選擇。果實(shí)重量是作物馴化和育種期間最重要的特征之一，包括開心果。在栽培種中，品種成分與果實(shí)重量呈正相關(guān)（圖4e）。這支持了一個結(jié)論，在開心果中，果實(shí)重量的人工選擇發(fā)生在馴化與人工選擇期間。研究人員指出，基因CYCD7-1在人工選擇的進(jìn)化下，野生種和馴化的栽培種之間具有高度的群體分化特征。該基因編碼D型細(xì)胞周期蛋白，控制細(xì)胞分裂及種子發(fā)育過程中的生長率。CYCD7-1基因的過表達(dá)包括在胚胎和胚乳中的細(xì)胞增殖和細(xì)胞增大，其在擬南芥中導(dǎo)致種子過度生長。基因CYCD7-1在花粉和早期發(fā)育中顯示特殊表達(dá)，但在葉和根中沒有表達(dá)。因此，有希望在未來的實(shí)驗(yàn)中比較野生型和馴化型開心果在花粉和早起發(fā)育時期CYCD7-1基因的表達(dá)，研究人員提出在CYCD7-1基因上進(jìn)行的人工選擇可能會改變開心果的重量。

?圖5 開心果果樹大小的人工選擇

結(jié)論

本研究為開心果的局部適應(yīng)和馴化提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。黃連木屬物種基因組序列有助于未來的研究，以了解沙漠作物農(nóng)藝和環(huán)境相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)。

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摘要概述

A high-quality, chromosome-scale Tartary buckwheat genome sequence of 489.3 Mb is assembled. A new buckwheat lineage-specific whole genome duplication is discovered. The reference genome facilitated the identification of many new genes predicted to be involved in rutin biosynthesis and regulation,aluminum stress resistance, and in drought and cold stress responses.

研究背景

苦蕎也叫苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）是蓼科蕎麥屬作物，雖然我們習(xí)慣認(rèn)為它屬于麥類，但其實(shí)他并非禾本科而是蓼科?？嗍w性喜陰濕冷涼，多種植于高山地域，一般垂直分布為海拔1200～3500m。所以苦蕎具有很高的抗逆性，尤其是在抗寒和抗干旱方面?？嗍w是藥食兩用的作物，苦蕎麥性味苦、平、寒, 有益氣力、續(xù)精神、利耳目、降氣寬腸健胃的作用。能降血壓、降血糖、降血脂, 改善微循環(huán)等作用, 又稱“三降”食品。其主要藥用成分為蘆丁，該文章也對蘆丁的生物合成進(jìn)行了研究。

測序材料

韃靼蕎麥（Fagopyrum tataricum cv. Pinku1），2n=2X=16；

測序方法

Illumina、BioNano、PacBio、Hi-C、fosmid

研究內(nèi)容

1.基因組組裝和注釋
苦蕎通過K-mer預(yù)估基因組大小約為489Mb，流式細(xì)胞儀預(yù)估為540Mb。共組裝出來489.3Mb的基因組序列，共8778個Contigs，Contig N50=550.7kb。通過Hi-C數(shù)據(jù)將436.4Mb的序列錨定到8條染色體上（定位比例為89.18%）。然后再通過光學(xué)圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。三代數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性通過二代評估為99.96%，并且在基因區(qū)具有更少的錯誤存在。

共預(yù)測得到33366個基因，平均每100Kb具有6.8個基因。非編碼RNA注釋結(jié)果為278 miRNAs, 1,395 tRNAs, 455 rRNAs, and 518 snRNAs。通過注釋已組裝基因組的50.96%為重復(fù)序列，其中LTR的比例占全基因組的38.64，包含Gypsy (30.52%) 和 Copia (5.48%)。

圖1 苦蕎基因組circle圖

2.系統(tǒng)發(fā)育和全基因組復(fù)制事件分析
苦蕎與擬南芥、可可、大豆、葡萄、楊樹、馬鈴薯、番茄以及單子葉的水稻和玉米構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，見下圖。此外還進(jìn)行基因家族聚類分析，找出共同和特有的基因家族。

圖2 苦蕎系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

通過苦蕎與擬南芥、苦蕎與甜菜進(jìn)行分析，通過Ks計(jì)算發(fā)現(xiàn)苦蕎經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件，近期是在下圖0.84-0.92之間，而更古老的一次復(fù)制發(fā)現(xiàn)在64.42~70.77 Mya。而全基因組復(fù)制事件的發(fā)生，也導(dǎo)致了很多與抗逆相關(guān)基因家族的擴(kuò)張或者保留。這也與后期苦蕎的抗逆性有一定關(guān)系。

圖3 苦蕎全基因組復(fù)制事件

3.參與蘆丁合成基因的鑒定
蘆丁的生物合成具有特殊的意義，而苦蕎被認(rèn)為是這種有益的類黃酮的主要食物來源?？喔墒w麥營養(yǎng)生物質(zhì)中含有3%的蘆丁。通過比較基因組以及不同生長部位的轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)原來所不知道的全長蛋白CHI(FtPinG0002790600)和f3h(FtPinG0006662600)。

圖4 蘆丁生物合成途徑的研究

4.苦蕎抗逆性研究
該研究還發(fā)現(xiàn)苦蕎中存在大量與植物耐鋁、抗旱和耐寒相關(guān)的新基因，其中產(chǎn)物包括一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。

小編總結(jié)

本文研究了苦蕎的基因組測序，除了三代測序還通過光學(xué)圖譜和Hi-C技術(shù)進(jìn)一步提升基因組的組裝質(zhì)量。通過比較基因組學(xué)研究明確了苦蕎的系統(tǒng)發(fā)育地位，以及通過全基因組復(fù)制事件的研究發(fā)現(xiàn)了抗逆基因的擴(kuò)張和保留。其中結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序?qū)μJ丁的生物合成途徑進(jìn)行了研究。

該研究由山西農(nóng)科院農(nóng)作物品種資源研究所喬治軍研究員團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所梁承志研究員團(tuán)隊(duì)及華南農(nóng)農(nóng)業(yè)大學(xué)王俊教授團(tuán)隊(duì)共同完成，其中百邁客只參與了其中部分研究，再次祝賀各位老師取得好的成績。

參考文獻(xiàn)

The Tartary buckwheat genome provides insights into rutin biosynthesis and abiotic stress tolerance.

The genome sequence of allopolyploid Brassica juncea and analysis of differential homoeolog gene expression influencing selection.

一 ?研究背景

圖1.蕓薹屬禹氏三角（From Wikipedia）

異源四倍體芥菜（AABB）屬于十字花科蕓薹屬，是重要經(jīng)濟(jì)作物，主要包括菜用和油用芥菜兩大類群，種植范圍較廣，經(jīng)濟(jì)價值較大。菜用芥菜主要分布在中國等東亞國家和地區(qū)，油用芥菜主要分布在印度等南亞國家和地區(qū)。芥菜是“禹氏三角”中重要的一員，由白菜和黑芥雜交后加倍而來，至少發(fā)生了三次古多倍化事件，因此非常具有研究價值。但是由于其為異源多倍體，相關(guān)的全基因組測序工作一直很難開展。來自浙江大學(xué)、北京百邁客等單位的團(tuán)隊(duì)共同合作，利用新的測序技術(shù)（PacBio+BioNano），成功的組裝出高質(zhì)量的芥菜基因組圖譜，為進(jìn)一步改良芥菜的農(nóng)藝性狀提供了基礎(chǔ)，為多倍體物種遺傳育種提供了新的方向。同時，也從多角度論證了芥菜A亞基因組起源問題，揭示了多倍體亞基因組間同源基因表達(dá)與選擇機(jī)制。

二 ?研究方法

1、組裝
基于文章設(shè)計(jì)，我們選取菜用芥菜的一個變種（榨菜），使用二代測序和三代測序相結(jié)合的方法進(jìn)行初步組裝，然后利用光學(xué)圖譜進(jìn)行校正，得到了一版高質(zhì)量的芥菜基因組，其中contig N50 由 28Kb 提升到61Kb ，scaffold N50 由710k 提升到1.5Mb.基因組完整性達(dá)到85%。另外我們還利用二代測序技術(shù)組裝了一版黑芥的基因組，基因組大小為591Mb，完整度為68%。
然后利用遺傳圖和光學(xué)圖譜對A、B亞基因組進(jìn)行區(qū)分,整體掛載效果非常好，A為91.48%，B為72.32%。利用光學(xué)圖譜和遺傳圖譜對基因組進(jìn)行區(qū)分，為其他多倍體物種基因組研究提供了參考。

2、基因組注釋情況
在高質(zhì)量的基因組的情況下，我們采用從頭+同源+轉(zhuǎn)錄組結(jié)合的方法在芥菜基因組中獲得了80050個編碼蛋白的基因，其中有97.8%的基因可以注釋到Nr庫。另外黑芥基因組預(yù)測出來49826個編碼蛋白的基因，其中94.7%可以注釋到Nr。重復(fù)序列部分芥菜A基因組中重復(fù)序列比例為44.25%，B為52.37%。芥菜基因組特征情況見下圖:

三 ?研究結(jié)果

1、芥菜A亞基因組起源問題
芥菜的基因組是異源四倍體（AABB），在“禹氏三角”中由白菜（AA），黑芥（BB）雜交后加倍形成，在演化過程中變異類型非常豐富。問題是油用芥菜的AA和菜用芥菜的AA是來自同一個亞種，還是來自多個亞種呢，這個問題就是A亞基因組的起源問題。

如上圖，a中對芥菜A、白菜A、甘藍(lán)型油菜A進(jìn)行共線性分析，可以發(fā)現(xiàn)其是高度共線的。
我們對10個菜用的芥菜、7個油用的芥菜，5個甘藍(lán)型油菜基因組、27個白菜基因組（多亞種）進(jìn)行了重測序分析，并繪制如上圖b中的進(jìn)化樹。從b圖中可以看到芥菜全部聚在一起，沒有出現(xiàn)分散的情況，說明芥菜中A的基因組是來源于同一個亞種，屬于單系起源。
C圖中對同源物種和芥菜進(jìn)行了進(jìn)化樹構(gòu)建，并計(jì)算了芥菜分化的具體時間為3-5萬年。
除了從群體的角度研究了芥菜亞基因組A起源問題，還從PCA聚類和Fixed SNP角度驗(yàn)正了單系起源的結(jié)論。

2、基因表達(dá)的dominance現(xiàn)象
由于芥菜基因組是異源四倍體，也就是說基因組中存在兩套非常相似的亞基因組，那么在基因表達(dá)的過程中，位于兩套亞基因組上的等位基因的表達(dá)模式是怎么樣的呢，是一起表達(dá)，是相互抑制，還是一方占主導(dǎo)？

通過計(jì)算等位基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在不同的時期，不同組織之間，發(fā)現(xiàn)存在dominance基因，存在dominance的基因經(jīng)受的選擇壓力大于Neutral基因（不存在dominance現(xiàn)象，功能非常重要，純化作用較強(qiáng)，不輕易突變），但是小于Subordinate基因（作用不重要，純化作用較小，易丟失）。

3、油用芥菜和菜用芥菜的選擇與分化
通過菜用和油用芥菜群體進(jìn)行選擇清除分析，發(fā)現(xiàn)dominance的基因被篩選出來的比例較高，同時結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，這部分基因在油用和菜用兩個群體中差異表達(dá)。同時通過上面的分析發(fā)現(xiàn)與硫苷，脂類代謝顯著相關(guān)并且存在dominance的基因組，這些基因在油用菜用群體中有各自獨(dú)特基因分型。

四 ?文章亮點(diǎn)

1. 多倍體復(fù)雜基因組解決方案：二代+三代+光學(xué)，組裝出高質(zhì)量復(fù)雜基因組；
2. 多個角度證據(jù)解決芥菜亞基因組A亞基因組單系起源/雜交起源爭論：Asubgenome phylogenetic tree，PCA, polymprphism and fixed SNP；
3. 通過構(gòu)建群體模型及貝葉斯方法評估多倍體芥菜形成時間上下限，為新多倍體物種形成時間估算提供新方法；
4. 從不同發(fā)育時期，不同組織，不同處理?xiàng)l件，不同進(jìn)化時期多個角度系統(tǒng)分析異源多倍體dominance 現(xiàn)象；
5. 通過油用菜用群體選擇角度識別vegetable- and oil- use B. juncea 分化選擇區(qū)域，發(fā)現(xiàn)與硫苷，脂類代謝顯著相關(guān)并且存在dominance的基因組，這些基因在油用菜用群體中有各自獨(dú)特基因分型；
6. 首次找到dominance gene 與潛在農(nóng)藝性狀選擇相關(guān)性的證據(jù)，為多倍體物種遺傳育種提供了新的方向和基因候選材料。

五 ?摘 要

The Brassica genus encompasses three diploid and three allopolyploid genomes, but a clear understanding of the evolution of agriculturally important traits via polyploidy is lacking. We assembled an allopolyploid Brassica juncea genome by shotgun and single-molecule reads integrated to genomic and genetic maps. We discovered that the A subgenomes of B. juncea and Brassica napus each had independent origins. Results suggested that A subgenomes of B. juncea were of monophyletic origin and evolved into vegetable-use and oil-use subvarieties. Homoeolog expression dominance occurs between subgenomes of allopolyploid B. juncea, in which differentially expressed genes display more selection potential than neutral genes. Homoeolog expression dominance in B. juncea has facilitated selection of glucosinolate and lipid metabolism genes in subvarieties used as vegetables and for oil production. These homoeolog expression dominance relationships among Brassicaceae genomes have contributed to selection response, predicting the directional effects of selection in a polyploid crop genome.

六 ?參考文獻(xiàn)

[1] The genome sequence of allopolyploid Brassica juncea and analysis of differential homoeolog gene expression influencing selection.