中文題目：5-ASA的腸道微生物代謝降低了其在炎癥性腸病中的臨床療效
發(fā)表期刊：nature medicine
發(fā)表時間：2023
影響因子：82.9
研究背景
炎性腸病 (IBD)是一種慢性、使人虛弱的胃腸疾病，治療失敗率較高。目前尚無系統(tǒng)的方法預(yù)測對IBD療法的反應(yīng)?？寡姿幬锩郎忱?，也被稱為5-氨基水楊酸 (5-ASA)，是IBD最常用的處方療法之一，通常在結(jié)腸內(nèi)發(fā)揮作用；然而，隨著時間的推移，超過一半的IBD患者對5-ASA沒有反應(yīng)或最終失去反應(yīng)。因此，有必要確定并消除此類治療失敗的原因。
研究思路
研究重點
1、來自IBD患者的多組學(xué)研究確定了5-ASA的使用
利用人類微生物組項目炎癥性腸病多組學(xué)數(shù)據(jù)庫（IBDMDB，http://ibdmdb.org），對79名克羅恩?。–D）或潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者的糞便樣本進行多組學(xué)分析，共鑒定了1036個宏基因組（MGX）、440個元轉(zhuǎn)錄本（MTX）和508個非靶向代謝組（MBX），以及283個MBX-MGX對和213個MGX-MTX對。隨后針對13名新使用5-ASA的患者來確定5-ASA在體內(nèi)直接調(diào)節(jié)的特定糞便代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-ASA使用前后中的5-ASA和N-乙酰5-ASA水平呈顯著差異，且經(jīng)5-ASA治療后，賴氨酸合成途徑中的細菌代謝產(chǎn)物—2-氨基己二酸的含量減少，煙酸代謝也發(fā)生了顯著變化。
進一步評估微生物、宿主和其他因素對這些差異顯著的代謝物的相對貢獻，最終發(fā)現(xiàn)5-ASA的藥物水平在確定5-ASA調(diào)節(jié)代謝物水平方面具有最大的預(yù)測能力（35%），其次是微生物組特征（15%）和其他宿主因素（7%）。隨后，通過另一個獨立的IBD患者隊列中鑒定并驗證了兩種可能的5-ASA衍生物—N-丙?；?-ASA和N-丁酰基5-ASA，它們的變化可以部分地由腸道微生物組來解釋。
圖1?5-ASA可直接影響糞便代謝組，并通過微生物組進行生物轉(zhuǎn)化
2、5-ASA代謝腸道微生物酶的鑒定
接下來確定參與5-ASA生物轉(zhuǎn)化的腸道微生物酶。首先對服用及未服用5-ASA的患者微生物進行轉(zhuǎn)錄組分析，最終鑒定了兩個顯著過表達的具有推定乙酰轉(zhuǎn)移酶功能的UniRef90基因簇：GNAT家族NAT（UniRef90 ID: C7H1G6）和乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶（UniRef90 ID: R6TIX3），以及四個具有乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的候選基因（IDs: R6CZ24, R5CY66, T5S060和A0A1C6JPG6）。隨后將糞便樣本分為N-乙酰5-ASA高水平和N-乙酰5-ASA低/陰性水平兩組，計算與N-乙酰5-ASA相關(guān)的每個元轉(zhuǎn)錄組基因簇的敏感性和特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了另外7個假定的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因簇與使用者的N-乙酰5-ASA水平呈正相關(guān)。最終得到的12個之前未被表征的候選乙酰轉(zhuǎn)移酶可分為硫解酶和?；o酶A N-酰基轉(zhuǎn)移酶兩組，其中酰基輔酶A NAT家族比硫解酶家族表現(xiàn)出更大的序列異質(zhì)性，且?；o酶A NAT酶幾乎都來自擬桿菌門，而硫解酶來自厚壁菌門。通過研究菌株水平的基因組，同樣發(fā)現(xiàn)了一部分普氏鐮孢菌株編碼相關(guān)的乙酰轉(zhuǎn)移酶。
圖2N-乙酰5-ASA微生物酶包括硫代酶和酰基輔酶A N-乙酰轉(zhuǎn)移酶
3、5-ASA失活酶生化特性的推定
為了推測硫解酶和?；o酶A NAT超家族具有潛在的5-ASA滅活能力，選用來自厚壁菌門的候選硫解酶CAG:176（UniRef90 ID: R6CZ24）和來自福氏假單胞菌的酰基輔酶A NAT（UniRef90 ID:C7H1G6）用于進一步的生化表征。用已知的腸道鏈球菌酶作為陽性對照，對乙?；?-ASA采用體外質(zhì)譜分析，最終證實了厚壁菌CAG:176硫解酶和F. prausnitzii?；o酶A NAT具有使用乙酰輔酶A乙酰化5-ASA的能力。
隨后測試了硫解酶對其他含胺基異生素（包括5-ASA異構(gòu)體4-ASA、異煙肼、普魯卡因胺和肼屈嗪）的乙酰化活性，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)這些化合物的任何乙?；?，這表明了硫解酶的底物選擇性。此外，編碼第二個預(yù)測的硫解酶基因（R6TIX3）的Oscillibacter sp菌株KLE 1745的活培養(yǎng)物也能夠?qū)?-ASA乙?；癁镹-乙酰基5-ASA。
為了深入了解厚壁菌CAG:176硫解酶（FcTHL）如何乙?；?-ASA，將FcTHL的乙酰化未配體晶體結(jié)構(gòu)疊加在乙酰化硫解酶晶體結(jié)構(gòu)上，與來自充分表征的革蘭氏陰性分枝菌（ZrTHL）的乙酰輔酶A復(fù)合。隨后將FcTHL與NAT (PDB ID: 2PFR)的晶體結(jié)構(gòu)進行比對，進一步探究厚壁菌CAG:176硫解酶的推定活性位點是否類似于腸道鏈球菌NAT的活性位點，最終揭示了活性位點區(qū)域中的半胱氨酸和組氨酸三聯(lián)體。
圖3?5-ASA在體外的乙?；钚缘淖C實
4、IBD治療失敗與5-ASA代謝酶的宏基因組攜帶有關(guān)
基于臨床服用5-ASA的個體差異性，接下來檢查12種乙酰轉(zhuǎn)移酶的存在是否與5-ASA治療失敗有關(guān)。收集39名在任何時間點接受5-ASA治療及使用類固醇患者的609份糞便樣本，使用多變量邏輯回歸模型，調(diào)整與疾病風(fēng)險相關(guān)了因素-年齡、性別、吸煙狀況和IBD亞型，納入每個參與者的NAT2表型來解釋宿主遺傳，最終發(fā)現(xiàn)糞便樣本中存在4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因與類固醇起始風(fēng)險增加顯著相關(guān)。4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因有三種來自硫解酶超家族，一種來自?；o酶A超家族。且較早的發(fā)病年齡和CD與UC狀態(tài)相比，同樣與開始使用類固醇的更高風(fēng)險顯著相關(guān)。但未發(fā)現(xiàn)類固醇使用風(fēng)險和大腸桿菌NAT的宏基因組存在聯(lián)系。
在敏感性分析中，微生物乙酰轉(zhuǎn)移酶基因數(shù)量的增加與類固醇起始風(fēng)險的增加顯著相關(guān)；從未使用過5-ASA治療的患者基因家族與類固醇的使用沒有正相關(guān)。隨后使用混合效應(yīng)模型對參與者進行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)存在三個或更多乙酰轉(zhuǎn)移酶基因也與類固醇使用風(fēng)險增加相關(guān)，這在隨后在未使用類固醇的208名5-ASA使用者隊列中得到了驗證。
圖4腸道微生物5-ASA滅活乙酰轉(zhuǎn)移酶與5-ASA使用者治療失敗的更大風(fēng)險相關(guān)
研究總結(jié)
本研究結(jié)果首次提供了特異性腸道代謝酶與IBD 5-ASA治療失敗之間的直接聯(lián)系，從而產(chǎn)生了直接的臨床潛力。5-ASA是UC最常用的處方藥。為了保持有效，它必須以未修飾的形式存在于結(jié)腸腔中，因此，與其他藥物不同，它在小腸中的吸收很差。5-ASA治療失敗的個體通常進展為風(fēng)險更高的免疫抑制治療，而只有在必要時 (即腸道微生物組中存在修飾5-ASA的硫解酶序列)才有能力這樣做，這將為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供有價值的生物標(biāo)志物。此外，闡明微生物失活5-ASA的酶學(xué)機制可能有助于未來研發(fā)微生物特異性酶抑制劑，以增強5-ASA的療效。在本研究中，我們的數(shù)據(jù)是觀察性的；需要更多的介入研究來加強我們的發(fā)現(xiàn)，無論是通過在IBD患者中的臨床試驗還是通過單定植小鼠。目前，這些發(fā)現(xiàn)為IBD的個性化微生物醫(yī)學(xué)打開了一扇概念之窗。
]]>1、前言
1.1適用范圍
本指南介紹百邁客動物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請詳細閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實物相符，避免因信息單與實物不符導(dǎo)致反復(fù)核對，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿足建庫測序要求，實驗周期過長等
1.2提取風(fēng)險提示
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長提取對樣的要求更高。組織提取時可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對較高質(zhì)量的核酸，請老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取
2、組織送樣量要求
注1：未在表格出現(xiàn)的物種，請單獨溝通。送樣量結(jié)果展示為滿足提取一次的量，如樣品經(jīng)過特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實驗可以順利進行，請酌情增加送樣量
注2：由于骨骼含有大量鈣鹽和礦物質(zhì)，細胞密度低，核酸含量較少；毛發(fā)暴露在外界環(huán)境，容易受到紫外線、溫度變化、微生物影響，導(dǎo)致核酸降解，毛干核酸含量低，毛囊周圍細胞多難獲取，為了保證您實驗的順利進行，這兩個部位不建議送組織樣，建議自行提取
| 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 組織部位（g/ml/個） | |||||||||
| 心臟 | 肝臟 | 脾臟 | 腎臟 | 腦 | 肌肉 | 腸道 | EDTA抗凝血液 | PAXgene管送樣血液 | 細胞 | |||
| 人 | DNA | 重測序 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 |
| 外顯子 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| 甲基化 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| ONT動植物基因組 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| PB動植物基因組 | 1 | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 5*10e6 | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 鼠 | DNA | 重測序 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 |
| 外顯子 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| 甲基化 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| ONT動植物基因組 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| PB動植物基因組 | 1 | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 5*10e6 | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 送樣量（g） |
| 皮膚 | DNA | 重測序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動植物重測序 | 1 | ||
| ONT動植物基因組 | 1 | ||
| PB動植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | ||
| 毛發(fā) | DNA | 重測序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動植物重測序 | 1 | ||
| ONT動植物基因組 | 1 | ||
| PB動植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | ||
| 骨骼 | DNA | 重測序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動植物重測序 | 1 | ||
| ONT動植物基因組 | 1 | ||
| PB動植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 |
3、核酸送樣要求
1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測結(jié)果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時請采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶對DNA樣品的污染，并詳細注明溶解DNA所使用的溶解液類型
2)如果您開展的實驗項目為miRNA的相關(guān)實驗，并且提供的是總RNA的樣本，請務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號備注送樣信息單中
3.1二代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | SLAF | 重測序 | 甲基化 | 外顯子 | FFPE | PCR產(chǎn)物 | PCR-free | chip-seq |
| 濃度ng/ul | 5 | 1 | 5 | 6 | 14 | 0.6 | 40 | 1 |
| 總量ug | 1.5 | 0.1 | 1 | 0.1 | 0.25 | 0.1 | 1 | 0.06 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 15 | 20 | 15 | 15 | 15 |
3.2三代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | ONT動植物重測序 | ONT動植物基因組 | PB動植物基因組 | 超長 |
| 濃度ng/ul | 40 | 100 | 50 | 50 |
| 總量ug | 4 | 10 | 15 | 15 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 50 |
3.3RNA類送樣量要求
1)針對核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量
2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實驗的開展
3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品
4)用乙醇沉淀的樣品由于運輸中會有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈
5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險，為保證樣本一次檢測合格并節(jié)約寶貴的重送樣時間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請在核酸量足夠的前提下盡量按照送樣建議來送樣。
| 項目類型 | 初檢結(jié)果（濃度、體積、純度） | 樣品狀態(tài) | ||
| 濃度（ng/ul） | 總量（ug） | 體積(ul) | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 20 | 1 | 15 | 正常 |
| 真核小RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
| 長鏈非編碼RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
4、樣品制備保存指南
4.1常規(guī)動物類樣本
送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對較高的組織，樣本制備優(yōu)先級：血液>內(nèi)臟>肌肉。活體取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈
4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產(chǎn)品適用）
1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內(nèi)）
2)活體取下新鮮的組織
3)迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈
4)如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大小）
5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號
6)立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存
7)干冰運輸
4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細胞和研磨后的組織適用）
1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請務(wù)必先進行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過量
2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運輸時選擇干冰寄送
3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣
4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）
1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm的小塊
2)如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長期保存
3)RNAlater? Solution 不會影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實驗所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存
4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時，樣本不會結(jié)凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時，樣本會結(jié)凍， 在進行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存
5)一般來講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實驗可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存
注：如果組織較小，建議優(yōu)先選擇此方式送樣
4.2全血
DNA類產(chǎn)品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類產(chǎn)品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時間過長。血液相關(guān)產(chǎn)品僅接收全血或分離的細胞樣本，不接收血清、血漿。
4.2.1DNA常規(guī)產(chǎn)品制備操作流程
1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3)干冰運輸
注1：血液采集管請盡量不要用需專門對應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無對應(yīng)試劑盒影響提取時間（盡量送樣前溝通）
注2：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎
4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程
4.2.2.1新鮮血液
1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標(biāo)記（樣本名稱，日期，體積）
2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置
3)冰袋（4 °C ）運輸需避開節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運輸至實驗人員手中不可超過 3 天
4.2.2.2凍存血液
1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次
2)哺乳動物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實際情況送樣）
3)魚類、禽類、兩棲類全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實際情況送樣）
4)做好標(biāo)記（樣本名稱， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送
4.2.3RNA產(chǎn)品制備操作流程
4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長類動物優(yōu)先選擇該方式送樣）
1)PAXgene管的介紹
在研究細胞內(nèi) RNA 使用的許多分子測試中，采集全血是第一步。 這類測試中的最大挑戰(zhàn)是細胞內(nèi) RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時內(nèi)迅速降解。 此外，通過基因誘導(dǎo)過程，某些種類的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導(dǎo)均會導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物相對數(shù)量估計過低或過高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導(dǎo)，可穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時，PAXgene 血液 RNA 管可以實現(xiàn)準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄物檢測和定量
2)采集前準(zhǔn)備
A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專用RNA穩(wěn)定劑）
B.符合標(biāo)準(zhǔn)的靜脈采血裝置（無菌針頭、持針器、止血帶等）
C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）
D.生物安全防護裝備（手套、護目鏡等）
3)采集流程
A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標(biāo)本識別標(biāo)簽
B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應(yīng)當(dāng)先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過程中使用的采血裝置的內(nèi)部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)是放血程序中最后抽吸的試管
C.采用您所在機構(gòu)推薦的標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管
D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次
E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲 PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時，最多 72 小時，然后再處理或轉(zhuǎn)移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲溫度，請參見“PAXgene 血液RNA 管內(nèi)所采集標(biāo)本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細信息
4)注意事項
A.確保采血管在有效期內(nèi)，無漏液或變色（正常試劑為淡黃色）
B.不可預(yù)先打開管蓋，避免穩(wěn)定劑失效
C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運輸期間破裂的風(fēng)險，請按照處理玻璃管的方式來處理冷凍的試管。使用者必須確認(rèn)自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運輸協(xié)議
D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會導(dǎo)致血液與附加劑的比率錯誤，且可能導(dǎo)致分析結(jié)果錯誤或產(chǎn)品性能欠佳
E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA
4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程
1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3)干冰運輸
4.3細胞
4.3.1貼壁細胞
4.3.1.1液氮速凍法
1)確定細胞生長狀態(tài)良好；離心得到細胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉(zhuǎn)速800g為宜）
2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中
3)離心（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送
4.3.1.2TRIzol裂解法
1)離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol
2)細胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解
3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送
注：判斷裂解液加入量是否合適的標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)細胞溶解物的黏度來判斷。在細胞剛?cè)芙鈺r，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應(yīng)繼續(xù)補加裂解液。裂解液加入量過少，會導(dǎo)致抽提的 RNA 降解
4.3.2懸浮細胞
4.3.2.1液氮速凍法
1)確定細胞生長狀態(tài)良好；離心得到細胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉(zhuǎn)速800g為宜）
2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中
3)離心（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送
4.3.2.2TRIzol裂解法
1)離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol
2)細胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解
3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送
5、注意事項
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實驗器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請務(wù)必按照送樣手冊所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取
1)組織速凍時間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時間過短會導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險
2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動物皮膚、毛發(fā)等。請嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實驗。采樣量較少會導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險
3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解
4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存
5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時間過短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解
6)組織送樣方式的選擇：干冰運輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護液送樣，化開離心會有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸
7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況
8)帶血組織：由于血液沒有專業(yè)的保護劑，去除不凈一起速凍送樣會影響組織的完整性
9)長年保存的組織：保存時間超過一年的組織不建議送樣
10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實驗時無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機選取適量組織提取
11)對于同一個組織樣品需要同時提取 DNA和 RNA 的，請務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的核酸質(zhì)量會造成不同程度的影響，常見的會導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過特殊處理的樣本，在送樣時，務(wù)必請在樣本信息單中進行詳細的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費
6、不合格樣品存在風(fēng)險
6.1樣本總量不足、濃度過低存在風(fēng)險
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機測序或測序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
6.2降解樣本風(fēng)險
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機測序或測序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機性差
6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常
6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染
1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問題質(zhì)量
2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫失敗，或即使達到上機要求也可能導(dǎo)致文庫隨機性差等問題
3)文庫構(gòu)建失敗
4)文庫產(chǎn)量低不能上機測序或測序數(shù)據(jù)量不足
6.4目標(biāo)RNA含量低
1)總RNA達到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫失敗
2)總RNA達到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫失敗或者測序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高
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文章標(biāo)題：Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma
期刊名稱：Journal for ImmunoTherapy of Cancer
影響因子：10.3
合作單位：空軍軍醫(yī)大學(xué)（第四軍醫(yī)大學(xué)）
研究方法：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，空間轉(zhuǎn)錄組測序，流式分選，RT-qPCR，Western blot，免疫組化，多重免疫組化，細胞實驗。
百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)DG1000單細胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)以及百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)，文中百創(chuàng)S1000空間數(shù)據(jù)分析得到的細胞空間分布圖由百創(chuàng)開發(fā)軟件BSTCellViewer展示。
研究背景
透明腎細胞癌ccRCC是腎細胞癌RCC的常見亞型，是腎癌相關(guān)死亡的主要原因，治療手段包括腎切除手術(shù)、靶向治療和免疫治療，但多數(shù)患者不能從免疫治療獲益，這與腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性有關(guān)，因此有必要深入理解ccRCC的腫瘤微環(huán)境，助力開發(fā)新型個性化診療方案。
材料及方法
研究材料：15名腎切除術(shù)的ccRCC患者組織樣本及其血液PBMC。對組織樣本區(qū)域進行定義，分為腫瘤核心（TC），腫瘤-健康交界（IF，包括腫瘤邊緣TR和臨近健康腎組織AN），遠端健康腎組織DN。
組別設(shè)計：實驗組4名ccRCC患者樣本進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序&空間轉(zhuǎn)錄組測序，驗證組15名ccRCC患者樣本進行流式細胞術(shù)&多重免疫熒光染色，151名ccRCC患者組織樣本&40名其他腎癌亞型患者組織樣本&6名捐獻者健康腎組織進行多重?zé)晒饷庖呓M化染色。
研究方法：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（4名患者不同區(qū)域腫瘤組織，按照CD45+細胞:CD45-細胞=9:1增加免疫細胞數(shù)據(jù)占比，n=12），空間轉(zhuǎn)錄組測序（n=4）；流式分選，RT-qPCR，Western blot，免疫組化，多重免疫組化，細胞實驗。
研究結(jié)果
1.ccRCC組織細胞類型全面分析
單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)顯示不同患者腫瘤組織的免疫微環(huán)境細胞組成相似，T細胞占比最高，特別是CD4+ T細胞。腫瘤區(qū)域（TC/TR）富集CD3+細胞以及CD8+ T細胞，而CD4+ T細胞基本分布在所有區(qū)域。此外，基質(zhì)細胞和免疫細胞豐度和分布存在差異，TR區(qū)域成纖維細胞比例顯著低于TC區(qū)域和AN區(qū)域，這一發(fā)現(xiàn)也在空間轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中得到印證。
圖1-ccRCC組織中細胞群的全面分析
2.ccRCC細胞元程序的豐度以及異質(zhì)性
通過非負矩陣因子分解分析每個樣本scRNA-seq數(shù)據(jù)，得到可以代表ccRCC腫瘤細胞簇元程序的6個基因集，不同基因集代表著不同的程序，如基因集1代表著EMT（上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變）相關(guān)基因表達譜，基因集5也與EMT相關(guān)但與基因集1不同的是其包含VEGFA等。
進一步分析，發(fā)現(xiàn)ccRCC亞群0~4簇與不同基因集表達譜匹配，5和6簇不與任何基因集匹配但具有細胞周期和應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)基因表達。RCC0簇和RCC2簇代表EMThigh腫瘤細胞并在IF區(qū)域富集，RCC1簇代表PT（近曲小管）細胞，擬時序分析結(jié)果顯示存在RCC0—>RCC2分化關(guān)系，但RCC2幾乎只在P2患者樣本中發(fā)現(xiàn)，表明RCC2可能與個別患者特征相關(guān)。RCC1、RCC3和RCC4細胞主要在組織而不是腫瘤區(qū)域富集，RCC4主要分布在AN和DN區(qū)域，RCC4在AN區(qū)域分布數(shù)量高于DN區(qū)域。RCC4高表達細胞因子受體基因，表明TME中分泌的促腫瘤細胞因子可能傾向于作用到RCC4，增加其轉(zhuǎn)變成癌細胞的概率，加速腫瘤逃逸，促進腫瘤惡性化，與以往瘤旁附近不是完全的健康組織認(rèn)識相符合。
圖2-透明細胞RCC細胞元程序的豐度及異質(zhì)性
3.ccRCC基質(zhì)細胞的區(qū)域化特征和異質(zhì)性
scRNA-seq與空間數(shù)據(jù)均顯示，ccRCC存在8種激活的成纖維細胞簇，腫瘤區(qū)域成纖維細胞數(shù)量高于健康組織，其中CD24+IL32+成纖維細胞顯著富集在腫瘤區(qū)域，PTGDS+成纖維細胞幾乎全分布在AN，高表達ECM（胞外基質(zhì)）形成和EMT的成纖維細胞簇在IF較為富集，IL1R1+?CAF（腫瘤相關(guān)成纖維細胞）表現(xiàn)出腫瘤促進表型；7種EC（內(nèi)皮細胞）簇中4種（0,2,3和6）主要富集在腫瘤組織，3種（1,4和5）在健康組織富集，膠原蛋白EC（0簇）豐度最高，具有促腫瘤特征?？傊?strong>不同的ECM蛋白質(zhì)產(chǎn)生基質(zhì)細胞傾向于富集在IF并共定位，可能行駛多種功能，包括細胞-細胞交互和胞外組分重構(gòu)。
圖3-透明細胞腎細胞癌中基質(zhì)細胞的區(qū)域特征和異質(zhì)性
4.ccRCC中MRC1+FOLR2+?TAM傾向于表現(xiàn)出更強的促癌表型
scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間數(shù)據(jù)均顯示，4種TAM簇具有不同分布趨勢，TAM1主要分布在TC區(qū)域；TAM2高表達FOLR2、MRC1和CD163，可能是M2樣巨噬細胞且具有增強的免疫抑制特征，TAM4是組織駐留巨噬細胞，兩者主要分布在TR區(qū)域；TAM3表達炎癥響應(yīng)相關(guān)基因，在TR和AN區(qū)域富集。RNA速率分析顯示存在TAM4—>TAM2—>TAM1和TAM4—>TAM3兩種軌跡，以及從IF區(qū)域遷移到TC區(qū)域的趨勢。進一步的功能分析顯示，IF區(qū)域的TAM2可能通過促進EMT，TC區(qū)域的TAM2可能通過促進腫瘤血管生成，起到促癌效應(yīng)?？傊?，TAM2不同的腫瘤促進效應(yīng)可能與免疫抑制TME有關(guān)。
圖4-透明細胞腎細胞癌中MRC1+FOLR2+?TAM傾向于表現(xiàn)更強的促癌表型
5.單細胞分析揭示ccRCC中存在表達IL1B的Treg
進一步分析CD4+ T細胞簇，發(fā)現(xiàn)存在CD4+ 初始T細胞、Treg和濾泡樣輔助T細胞，不同簇的特征基因和空間分布模式不同，IF區(qū)域富集CD4+ 初始T細胞和PDE3B+ CD4+ T細胞，腫瘤區(qū)域富集Treg。其中，TC/TR區(qū)域CTLA-4+?Treg的占比以及Treg的FoxP3蛋白表達水平高于AN/DN區(qū)域，而CTLA-4+FoxP3-?Treg在所有組織中的分布較為均勻，表明腫瘤區(qū)域Treg細胞具有更強的免疫抑制功能。
進一步分析Treg細胞簇，發(fā)現(xiàn)存在6種亞型，其中終末效應(yīng)Treg細胞（5）主要分布在IF區(qū)域，F(xiàn)OXP3表達水平較低且ICOS表達水平降低，表明細胞可能處于不穩(wěn)定狀態(tài)。
此外，終末效應(yīng)Treg細胞表達炎癥性細胞因子如IL1B，IL18和IL7，驗證隊列的多重免疫熒光染色結(jié)果顯示IL-1β+終末效應(yīng)Treg是對ccRCC特異性腫瘤微環(huán)境信號的特異性響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在表達炎癥性細胞因子IL1B的終末效應(yīng)Treg細胞。
圖5-單細胞分析揭示透明細胞腎細胞癌存在表達IL1B的Treg細胞群
6.IL-18通過ERK/NF-κB通路促進強免疫抑制功能的終末效應(yīng)Treg細胞產(chǎn)生
空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示不同Treg細胞100μm范圍內(nèi)激活的CD4+/CD8+ T細胞數(shù)量較少，終末效應(yīng)Treg細胞100μm范圍內(nèi)CD4+/CD8+ T細胞數(shù)量更少，表明終末效應(yīng)Treg細胞周圍應(yīng)答Treg細胞（Tresp）增殖受到更強的抑制。細胞共培養(yǎng)實驗表明終末效應(yīng)Treg細胞具有強免疫抑制功能。RNA速率分析結(jié)果表明效應(yīng)終末Treg可能由初始Treg細胞分化而來，體外實驗表明IL-18可刺激CD4+CD25+ Treg細胞上調(diào)IL-1β表達，表明終末效應(yīng)Treg細胞產(chǎn)生和作用可能與IL-18有關(guān)。ERK激活劑/NF-κB激活劑促進IL-18+ Treg細胞的產(chǎn)生，IL-18處理后Treg細胞ERK/NF-κB磷酸化水平增加，ERK抑制劑可抑制Treg細胞表達NF-κB但NF-κB抑制劑無法抑制ERK表達，綜上，這些結(jié)果表明IL-18可能通過ERK/NF-κB通路介導(dǎo)終末效應(yīng)Treg細胞的產(chǎn)生。
圖6-IL-18通過ERK/NF-κB通路促進具有強免疫抑制功能的終末效應(yīng)Treg細胞產(chǎn)生
7.通過與MRC1+FLOR2+?TAM互作，終末效應(yīng)Treg細胞與存活率降低、免疫逃逸增加及腫瘤生長相關(guān)
確定終末效應(yīng)Treg細胞標(biāo)志基因（FOXP3、IL1B和FCER1G），TGCA泛癌數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，終末效應(yīng)T細胞浸潤高的隊列與更低的整體存活率相關(guān)。細胞通訊分析結(jié)果顯示，巨噬細胞與終末效應(yīng)Treg細胞有著最多的互作配體-受體對，許多是免疫抑制互作，驗證實驗支持終末效應(yīng)Treg細胞與TAM2簇之間存在相互作用；IL1R1+?CAF與終末效應(yīng)Treg細胞也存在潛在聯(lián)系。僅在TC區(qū)域（與TR區(qū)域相比）發(fā)現(xiàn)NAMPT-INSR和TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2)配受體互作，體外實驗發(fā)現(xiàn)終末效應(yīng)Treg細胞LRRC32（該基因編碼的GARP是TGF-β1成熟和激活所必須的）表達水平高于傳統(tǒng)Treg細胞。
此外，巨噬細胞特別是TAM2高表達IL18。這些結(jié)果可能表明ccRCC腫瘤微環(huán)境中，IF區(qū)域終末效應(yīng)Treg細胞與臨近TAM2互作，通過分泌的TGF-β1、M-CSF1以及IL-10，將IF駐留的TAM轉(zhuǎn)變成促癌表型，引起腫瘤細胞EMT；TAM2分泌的趨化因子誘導(dǎo)Treg細胞遷移到腫瘤區(qū)域并過表達IL-18，將Treg細胞轉(zhuǎn)變成IL-1β+ 終末效應(yīng)T細胞，抑制T細胞免疫并促進腫瘤生長。
總之，這些結(jié)果表明ccRCC的IF區(qū)域，終末效應(yīng)Treg細胞可能與其他促癌細胞互作，最終促進腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化，支持了終末效應(yīng)Treg細胞具有免疫抑制和促癌作用的假設(shè)。
研究結(jié)果
該研究系統(tǒng)描述了ccRCC中不同類型細胞的基因表達譜和空間分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)一種具有癌癥促進作用的新Treg細胞亞型，在腫瘤-健康組織交界區(qū)域與MRC1+FOLR2+?TAM互作，構(gòu)建免疫抑制TME，促進腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化最終引起患者存活率降低。同時，這些發(fā)現(xiàn)也為開發(fā)新的藥物和預(yù)后標(biāo)志物提供了靶點。
參考文獻：
Song X, et al. Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma. J Immunother Cancer. 2025 13(1):e010183.
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2025年3月，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院器官移植研究所蘭培祥教授、陳知水教授和肝臟外科程琪教授研究團隊在Journal of Hepatology發(fā)表題為”Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury”的研究論文。研究使用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)等多種技術(shù)，深入闡述人鼠中減輕肝缺血再灌注損傷的腦-肝軸調(diào)控通路，發(fā)現(xiàn)酸味刺激竟然可以通過神經(jīng)信號緩解肝臟損傷！這一發(fā)現(xiàn)不僅為肝臟疾病的治療提供了新思路，還從現(xiàn)代科學(xué)的角度驗證了中醫(yī)“酸入肝”的理論。
文章標(biāo)題：Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury
期刊名稱：Journal of Hepatology
影響因子：26.7
合作單位：華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院
百邁客生物為該研究提供了10X單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)服務(wù)。
研究背景
在中醫(yī)理論中，酸味與肝臟有著密切的關(guān)系。中醫(yī)經(jīng)典《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提到“酸入肝”，認(rèn)為酸味食物能夠滋養(yǎng)肝臟，調(diào)和氣血，促進肝臟的生理功能。像檸檬、山楂、醋等酸味食物，常被用來調(diào)理肝氣郁結(jié)、疏肝解郁。這次的研究，不僅讓中醫(yī)的古老智慧得到了科學(xué)驗證，還為酸味在肝臟疾病治療中的應(yīng)用提供了新的依據(jù)。
肝損傷是多種肝病常見的病理生理基礎(chǔ)，與炎癥有關(guān)。肝缺血再灌注損傷是一種局部無菌炎癥響應(yīng)，主要由先天免疫細胞驅(qū)動，是肝切除術(shù)中早期器官功能障礙和衰竭的重要原因。傳統(tǒng)認(rèn)為肝缺血再灌注引起的炎癥是由肝和死亡細胞釋放的DAMP（損傷相關(guān)分子蛋白）被肝駐留庫普夫細胞、單核細胞、單核-巨噬細胞等識別，釋放趨化因子和促炎癥因子，招募循環(huán)白細胞促使炎癥發(fā)生。此外，近年來，神經(jīng)免疫調(diào)控成為研究熱點，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)可以通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽等分子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。然而，如何通過神經(jīng)信號來治療肝臟炎癥，仍然是一個未解之謎。
材料及方法
研究方法：單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序（n=3，肝及腹腔神經(jīng)節(jié)），組織學(xué)染色，熒光染色，病毒示蹤，免疫印記，免疫沉淀串聯(lián)質(zhì)譜，bulk RNA-seq，qRT-PCR，流式細胞術(shù)等。
研究材料：C57BL/6J小鼠缺血再灌注損傷模型，Fam19a2-/-Ccr2-/-小鼠，小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT122。
研究結(jié)果
1.酸刺激減輕肝缺血再灌注損傷
研究者首先構(gòu)建酸刺激下肝臟缺血再灌注損傷（IRI）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)酸刺激可以減少肝組織損傷以及血清標(biāo)志物水平。但是，使用丁卡因局麻小鼠舌頭或者灌胃檸檬酸不能減少肝損傷和血清標(biāo)志物水平；NMDAR阻斷劑1（阻斷NMDAR介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞）立體定位注射到腹后內(nèi)側(cè)核（VPN）后，酸刺激后IRI肝的血清標(biāo)志物水平和肝損傷程度無明顯變化，表明神經(jīng)系統(tǒng)在酸刺激減輕IRI過程中起重要作用。此外，小鼠VPN注射示蹤病毒的實驗結(jié)果顯示，肝臟以及CG（腹腔神經(jīng)節(jié)）均檢測到熒光，行腹腔神經(jīng)節(jié)切除術(shù)能降低IRI肝的組織損傷和血清標(biāo)志物水平，表明酸刺激減輕肝損傷過程通過腦-CG-肝軸。
圖1-酸通過神經(jīng)減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷
圖2-腦和肝中分布的H129感染神經(jīng)
2.酸刺激通過減少TAFA2產(chǎn)生降低肝IRI
對肝IRI小鼠、酸刺激后肝IRI小鼠及sham（假手術(shù)）小鼠的肝臟和CG進行單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果顯示IRI引起肝細胞和神經(jīng)元基因表達譜發(fā)生變化，IRI肝中免疫細胞數(shù)量增加，但酸刺激后IRI樣本中免疫細胞數(shù)量減少。神經(jīng)元較為特異性地表達TAFA2，IRI可引起肝神經(jīng)元TAFA2表達水平增加，但酸刺激使得TAFA2表達水平降到與sham對照組相近水平。實驗發(fā)現(xiàn)鉀離子可引起小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22顯著高表達TAFA2，使用鉀離子通道抑制劑可減輕肝損傷，支持酸刺激通過神經(jīng)系統(tǒng)減輕肝損傷的假設(shè)。進一步的，使用慢病毒敲低神經(jīng)元TAFA2表達水平或使用TAFA2敲基因鼠，發(fā)現(xiàn)IRI引起的肝組織損傷、巨噬細胞浸潤以及血清標(biāo)志物水平降低，表明TAFA2在肝IRI中有著重要作用。
圖3-酸刺激減少小鼠IRI肝中神經(jīng)細胞Fam19a2表達水平
圖4-Fam19a2敲除或敲低，使得小鼠肝臟缺血再灌注損傷降低
?3.IRI肝中TAFA2與巨噬細胞相互作用
體外實驗發(fā)現(xiàn)TAFA2不引起肝細胞凋亡；snRNA-seq數(shù)據(jù)顯示IRI肝中巨噬細胞比例增加且炎癥相關(guān)基因表達水平增加，但在酸刺激組中降低；流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明，TAFA2與巨噬細胞結(jié)合而不與T/B細胞結(jié)合，不論是否酸刺激T/B細胞比例無顯著變化，IRI肝中CD11b+F4/80low?巨噬細胞增加而酸刺激可降低該巨噬細胞數(shù)量；TAFA2敲除或敲低抑制IRI肝中巨噬細胞的浸潤，這些結(jié)果表明TAFA2促進巨噬細胞活化。體外實驗結(jié)果表明，TAFA2可以激活BMDM（骨髓來源巨噬細胞），引起Il1α，Il1β，Il6和Tnfα的表達，這些結(jié)果表明TAFA2激活的巨噬細胞介導(dǎo)了肝IRI。
圖5-TAFA2使得IRI中巨噬細胞比例增加，刺激炎性細胞因子的產(chǎn)生
4.TAFA2通過CCR2與巨噬細胞互作
體外實驗表明巨噬細胞上的CCR2是TAFA2受體，CCR2敲除小鼠IRI肝的組織損傷以及巨噬細胞浸潤降低，血清標(biāo)志物水平降低。TAFA2或CCL2刺激后BMDM的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)表現(xiàn)出幾乎一致的轉(zhuǎn)錄組表達譜，粘附、代謝、Ras信號通路相關(guān)差異基因表達上調(diào)，代謝和核糖體通路相關(guān)基因表達下調(diào)，TAFA2誘導(dǎo)BMDM更高的表達Il1α，Il1β，Il6，Tnfα以及干擾素相關(guān)基因，促進巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)。進一步實驗表明TAFA2促使巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)主要依賴CCR2，但巨噬細胞上也可能存在其他的TAFA2受體。
圖6-TAFA2與巨噬細胞表面CCR2互作
5.酸刺激減輕人類肝切除術(shù)中肝IRI
為了確認(rèn)酸刺激在人類肝IRI中的作用，研究者進行了開放、隨機、空白對照臨床試驗（ChiCTR2400088096），包含多種良性/惡性肝腫瘤、肝外傷、膿腫、囊腫和包蟲病，由于手術(shù)期間門靜脈短暫阻斷以減少肝切除過程中出血，導(dǎo)致肝出現(xiàn)缺血再灌注損傷。干預(yù)組33名患者，術(shù)前24h開始，每8h給與新鮮的25mM檸檬酸（持續(xù)5min），對照組33名患者不接受酸刺激，剔除6名術(shù)中肝缺血超過30min患者以及4名依從性差患者，肝切除術(shù)后第1/3/5天對患者肝功能進行評估，結(jié)果顯示酸刺激組血清ALT和AST水平顯著低于對照組，高ALT水平（>500 U/L）患者數(shù)量也顯著更低，這些結(jié)果表明酸刺激可減輕人類肝切除術(shù)引起的肝IRI。
圖7-酸刺激減輕人類肝切除術(shù)中肝IRI
研究總結(jié)
該研究首次揭示了腦-肝軸在肝臟IRI中的調(diào)控作用，闡明了酸味刺激通過神經(jīng)信號通路緩解肝臟損傷的機制。研究不僅為肝臟IRI的治療提供了新的思路，還為神經(jīng)免疫調(diào)控在其他器官炎癥中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。研究團隊表示，未來將進一步探索神經(jīng)刺激療法在肝臟疾病中的應(yīng)用，特別是通過調(diào)控腦-肝軸來緩解肝臟炎癥和損傷。此外，研究團隊還將深入研究TAFA2蛋白的作用機制，開發(fā)針對TAFA2-CCR2信號通路的靶向藥物，為肝臟疾病的治療提供更多選擇。
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- 發(fā)表期刊：Cancer Cell
- 影響因子：48.8
- 發(fā)表日期：2025-2-6
- 發(fā)表單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院
- 課題切入點：本文研究了三陰性乳腺癌（TNBC）中不同治療方案對腫瘤免疫微環(huán)境（TME）的影響，特別是探討了化療與程序性死亡配體1（PD-L1）阻斷聯(lián)合療法的細胞機制。
- 研究?材料?：研究從44名TNBC患者中獲取了78份腫瘤活檢樣本，包括接受nab-紫杉醇（Nab-PTX）聯(lián)合阿替利珠單抗（ATZ）、Nab-PTX單藥、紫杉醇（PTX）聯(lián)合ATZ以及PTX單藥治療的患者。
- 研究方法?：采用單細胞RNA測序（scRNA-seq）和T細胞受體測序（TCR-seq）技術(shù)，對TNBC中的免疫細胞浸潤進行了詳細分析。此外，還利用小鼠4T1乳腺癌模型進行了體內(nèi)驗證實驗，包括RNA測序和流式細胞術(shù)分析。?·?研究結(jié)論?：研究發(fā)現(xiàn)，不同治療方案下，TNBC中的免疫細胞組成發(fā)生顯著變化。Nab-PTX聯(lián)合ATZ治療顯著減少了耗竭性CD8+T細胞（Tex）的比例，同時增加了具有干細胞樣特征的中央記憶T細胞（Tcm）和效應(yīng)記憶T細胞（Tem）的比例。B細胞亞群，特別是濾泡B細胞（Bfoc），在Nab-PTX聯(lián)合ATZ治療的響應(yīng)者中顯著富集，且B細胞水平與有利反應(yīng)相關(guān)。此外，研究還揭示了不同DC亞群之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系，以及它們與T細胞反應(yīng)之間的相互作用。肥大細胞在Nab-PTX相關(guān)治療中顯示出增加的趨勢，且其浸潤水平與有利反應(yīng)相關(guān)。體內(nèi)實驗進一步證實了肥大細胞激活可以增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而提高PD-L1阻斷療法的有效性。
這些發(fā)現(xiàn)不僅增進了我們對TNBC中免疫細胞動態(tài)及其與治療反應(yīng)之間關(guān)系的理解，還為開發(fā)新的化療免疫聯(lián)合療法提供了潛在的治療靶點。
- 發(fā)表期刊：Annals of Oncology
- 影響因子：56.7
- 發(fā)表日期：2025-2-4
- 發(fā)表單位：英國倫敦癌癥研究所和英國倫敦皇家馬斯登醫(yī)院
- 課題切入點：該研究探討了基于全基因組測序（WGS）的超靈敏循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測技術(shù)在早期乳腺癌分子殘留病灶（MRD）監(jiān)測和復(fù)發(fā)預(yù)測中的應(yīng)用?！?研究樣本：研究團隊分析了78例早期乳腺癌患者（包括23例三陰性乳腺癌、35例HER2陽性、18例HR陽性及2例未知亞型）的617份血漿樣本，覆蓋診斷前、新輔助化療期間、術(shù)后及長期隨訪（中位隨訪76個月）多個時間點?；颊哐獫{樣本來自英國多家醫(yī)療中心，包括診斷前、新輔助化療周期、術(shù)后及定期隨訪樣本。
- 研究方法：對腫瘤組織進行全基因組測序（中位深度38×），篩選高可信度體細胞變異構(gòu)建個性化檢測panel。血漿游離DNA（cfDNA）經(jīng)高通量測序后，通過分子共識算法抑制背景噪聲，計算ctDNA水平。所有樣本通過NeXT Personal MRD平臺進行檢測，該平臺基于腫瘤組織的全基因組測序數(shù)據(jù)，為每位患者個性化設(shè)計檢測panel，追蹤中位數(shù)1451個體細胞變異，檢測靈敏度可達百萬分之一（1 PPM）。
- 數(shù)據(jù)分析：采用Kaplan-Meier生存分析和Cox比例風(fēng)險模型評估ctDNA檢測與臨床結(jié)局（復(fù)發(fā)無生存期RFS、癌癥特異性生存期CSS）的關(guān)聯(lián)，并通過時間依賴性模型動態(tài)評估MRD狀態(tài)對預(yù)后的影響。
- 研究結(jié)果：1. 診斷階段：98%（49/50）的患者在治療前檢測到ctDNA，涵蓋所有亞型（HER2+和TNBC均為100%，HR+為88%）。診斷時ctDNA水平升高與較差的RFS（HR=1.82）和CSS（HR=2.19）顯著相關(guān)。2. 術(shù)后監(jiān)測：所有復(fù)發(fā)患者（11/11）在臨床復(fù)發(fā)前均檢測到ctDNA（中位提前15個月），未檢測到ctDNA的患者（64/64）均未復(fù)發(fā)。術(shù)后ctDNA陽性與RFS和CSS顯著惡化相關(guān)（均P<0.0001）。3. 靈敏度優(yōu)勢：39%的ctDNA陽性樣本處于超低水平（<100 PPM）。與全外顯子測序（WES）和數(shù)字PCR（dPCR）相比，WGS方法在匹配樣本中檢測率更高（WGS 100% vs. WES 84% vs. dPCR 76%）。4. 動態(tài)預(yù)后：術(shù)后6周或6個月未檢測到ctDNA的患者預(yù)后顯著改善。此外，術(shù)后早期ctDNA清除（如輔助治療后）可能提示疾病控制良好。
- 研究結(jié)論：WGS驅(qū)動的超靈敏ctDNA檢測技術(shù)顯著提升了早期乳腺癌MRD監(jiān)測的敏感性和特異性，可提前預(yù)測復(fù)發(fā)并指導(dǎo)臨床決策。其高陰性預(yù)測值（NPV 100%）支持在低風(fēng)險患者中探索治療降階梯策略，而陽性結(jié)果則為早期干預(yù)提供了依據(jù)。未來需擴大樣本量并開展前瞻性研究以驗證其臨床實用性。
Ps：關(guān)注醫(yī)學(xué)領(lǐng)域腫瘤研究請聯(lián)系當(dāng)?shù)貥I(yè)務(wù)經(jīng)理獲取原文~
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本次為各位老師帶來重慶醫(yī)科大學(xué)黃愛龍教授/唐開福教授團隊在nature子刊?Nature Communications?中發(fā)表的題目為“SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia”的文章。該文章研究了 SARS-CoV-2 N 蛋白如何影響 RNA 干擾 (RNAi) 和 RNA 剪接途徑，并揭示了這些途徑在 COVID-19 發(fā)病機制中的作用，有助于開發(fā)更有效的 SARS-CoV-2 相關(guān)肺炎治療方法。
中文題目：SARS-CoV-2 N蛋白誘導(dǎo)的Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3下調(diào)導(dǎo)致肺炎
英文題目：SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia
發(fā)表期刊：Nature Communications?
影響因子：14.7
合作單位：重慶醫(yī)科大學(xué)
百邁客生物為該研究提供了小RNA測序和ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。
研究背景
2019 冠狀病毒病 （COVID-19） 由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒 2 （SARS-CoV-2） 引起，具有高度異質(zhì)性，且發(fā)病病例分布在各個年齡群體中，但重癥及死亡率明顯字老年群體比較集中。DNA 損傷是導(dǎo)致衰老的關(guān)鍵因素，也是 COVID-19 發(fā)病機制的驅(qū)動因素，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失是衰老的另一個標(biāo)志，會導(dǎo)致不受抑制的炎性小體激活、功能失調(diào)的細胞器積累和細胞損傷，可能導(dǎo)致 COVID-19 的發(fā)病機制。Dicer 是 RNA 干擾 （RNAi） 通路的關(guān)鍵組成部分，在衰老過程中下調(diào)， RNAi 組分的敲除會導(dǎo)致 DNA 損傷，并且可能由于 miRNA的整體下調(diào)而增加蛋白質(zhì)合成，從而影響蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，與年齡相關(guān)的剪接因子失調(diào)發(fā)生在不同生物體的多個組織中，并且與基因組穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)，可通過R環(huán)誘導(dǎo) DNA 損傷。然而，RNAi 成分及RNA 剪接因子在 COVID-19 發(fā)病機制中的確切作用還有待明確。
材料和方法
材料：異位表達 N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細胞系 ，N 蛋白誘導(dǎo)的雄性肺損傷小鼠及正常對照 C57BL/6J 雄性小鼠；
方法：小RNA測序+ONT全長轉(zhuǎn)錄組+免疫組化+RIP等
研究結(jié)果
1.SARS-CoV-2核衣殼 （N） 蛋白誘導(dǎo)自噬降解及DNA損傷的作用機制
通過對已發(fā)表的COVID-19 患者RNA測序數(shù)據(jù)的分析，確定了重癥 COVID-19 患者 M-MDSC 中 RNAi 成分和剪接因子的 mRNA 水平低于無癥狀 COVID-19 患者，且已故 COVID-19 患者肺組織中的 RNAi 成分和剪接因子水平也低于未感染 COVID-19 的個體，表明RNAi 成分和剪接因子的表達減少與 COVID-19 感染加重有關(guān)。
細胞沉默逆轉(zhuǎn)測定使用含有內(nèi)含子的熒光素酶報告基因小基因證明了 SARS-CoV-2 抑制了該小基因的剪接。該研究從相互作用數(shù)據(jù)集的生物通用存儲庫 （BioGRID） 中檢索了 N 蛋白的推定蛋白質(zhì)相互作用子，并用免疫共沉淀測定證實了異位表達 N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細胞系中 N 蛋白與?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3?之間的相互作用，進一步定量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3在蛋白水平上下調(diào)，但在 mRNA 水平上不下調(diào)，而自噬抑制劑氯喹或巴弗洛霉素 A1 治療可緩解 N 蛋白或 SARS-CoV-2 誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調(diào)，用蛋白酶體抑制劑 MG132 處理并無效果，表明?N 蛋白對?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達的影響是自噬依賴性的。
在 BioGRID 數(shù)據(jù)庫中找到了一種自噬受體蛋白SQSTM1/p62 ，共聚焦顯微鏡分析和免疫共沉淀分析分別證實了 N 蛋白和 p62 之間的相互作用及其共定位，p62 敲低部分緩解了 N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白的下調(diào)；然而，它不會影響不表達 N 蛋白的細胞中的?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?蛋白水平，表明?p62 通過與 N 蛋白的相互作用將 N 蛋白相互作用蛋白（包括?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3）募集到吞噬細胞中，導(dǎo)致自噬降解。
ATM等的磷酸化、DNA 斷裂積累等病灶形成證明了異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 DNA 損傷，敲低?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?導(dǎo)致 DNA 損傷，而它們的過表達部分減輕了 N 蛋白誘導(dǎo)的 DNA 損傷，同時異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 R 環(huán)積累，進一步誘導(dǎo)DNA損傷，RNase H1（一種降解 R 環(huán)的 RNA 部分的核糖核酸內(nèi)切酶）的過表達部分減輕了這種影響并減少了 DNA 損傷積累，總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明?N 蛋白誘導(dǎo)的 Dicer 、 XPO5 、 SRSF3 和 hnRNPA3 表達下調(diào)導(dǎo)致 DNA 損傷。
2.SARS-CoV-2 N蛋白通過抑制 miRNA 生物發(fā)生及抑制 RNA 剪接作用機制
XPO5和Dicer在 miRNA 生物合成中起關(guān)鍵作用，小 RNA 深度測序顯示，N 蛋白誘導(dǎo) miRNA 表達的整體下調(diào)，對 A549 和 BEAS-2B 細胞中表達量最高的前五個 miRNA進行定量驗證顯示，它們在表達 N 蛋白的細胞和 SARS-CoV-2 感染的細胞中均下調(diào)；生化分級分離實驗顯示，異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo) pre-miRNA 的核保留，如細胞核中 pre-miRNA 水平的增加和細胞質(zhì)中 pre-miRNA 水平的降低所示，?XPO5過表達后得到緩解。此外，異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染降低了成熟 miRNA 和 pre-miRNA 之間的比率，Dicer過表達后得到緩解?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明，N 蛋白通過降低?XPO5?表達阻斷 pre-miRNA 從細胞核到細胞質(zhì)的運輸，并通過下調(diào)?Dicer?表達抑制 pre-miRNA 向成熟 miRNA 的加工。
SRSF3或hnRNPA3敲除抑制了含有內(nèi)含子的報告基因小基因的剪接，證實了它們確實是剪接因子，而它們的過表達部分緩解了 N 蛋白或 SARS-CoV-2 感染對 RNA 剪接的抑制作用，進一步進行全長轉(zhuǎn)錄組測序，通過可變剪接分析發(fā)現(xiàn)，N 蛋白誘導(dǎo)內(nèi)含子保留。此外，RT-qPCR證實，異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染降低了一組內(nèi)源性內(nèi)含子的剪接效率，SRSF3?和?hnRNPA3?過表達部分減輕了 N 蛋白和 SARS-CoV-2 對 RNA 剪接的抑制作用，這些結(jié)果表明，N 蛋白通過降低?SRSF3?和?hnRNPA3?的表達來抑制 RNA 剪接。
剪接抑制會誘導(dǎo)廣泛的 IR 和隨后的內(nèi)含子保留 mRNA 的翻譯，一部分內(nèi)含子衍生的多肽容易縮合且具有蛋白毒性，用嘌呤霉素對新生多肽進行代謝標(biāo)記，結(jié)果顯示異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)不溶性蛋白合成增加，而N蛋白與RNA的結(jié)合主要在可溶性蛋白部分被檢測到，免疫熒光檢測結(jié)果表明，N 蛋白和 SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)了 EGFP 聚集體的產(chǎn)生，誘導(dǎo)蛋白毒性應(yīng)激。
3.SARS-CoV-2 N 蛋白在蛋白水平的影響及動物模型驗證
盡管異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致 4EBP1 去磷酸化，但它增加了整體蛋白質(zhì)合成，而沒有顯著影響 S6K1 磷酸化，對照組的刺突蛋白和膜蛋白對整體蛋白質(zhì)合成沒有影響，而包膜蛋白甚至抑制了整體蛋白質(zhì)合成，Dicer?或?XPO5?敲低導(dǎo)致 JNK 激活和 4EBP1 去磷酸化，同時略微增加 S6K1 磷酸化并促進蛋白質(zhì)合成，表明 N 蛋白通過降低?Dicer?和?XPO5?表達來促進蛋白質(zhì)合成，并通過下調(diào)?SRSF3?和?hnRNPA3?表達來抑制蛋白質(zhì)合成。由于?Dicer?和?XPO5?的下調(diào)比?SRSF3?和?hnRNPA3?的下調(diào)更顯著地促進蛋白質(zhì)合成，因此 N 蛋白最終增強了蛋白質(zhì)合成。
小鼠體內(nèi)驗證結(jié)果顯示， N 蛋白在小鼠肺組織中的表達導(dǎo)致?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調(diào)、DNA 損傷、胞質(zhì) DNA 積累、細胞凋亡、IFNβ、IL-6 和 NKG2D 配體上調(diào)，以及伴有明顯巨噬細胞浸潤的肺炎，肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低導(dǎo)致肺損傷和肺炎，而它們的過表達部分緩解了 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎，這些結(jié)果表明，N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達下調(diào)是 SARS-CoV-2 誘導(dǎo)肺炎的一種機制。
分析已發(fā)表的 3、6、12 和 24 個月齡 C57BL/6J 小鼠肺組織的 RNA 測序數(shù)據(jù)，在 8 周齡和 18 個月齡 C57BL/6J 小鼠的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上證實了肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡依賴性下調(diào)， DNA 損傷、細胞凋亡等功能在老年小鼠中明顯富集，結(jié)合Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低實驗，表明，Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡相關(guān)下調(diào)與 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎嚴(yán)重程度增加有關(guān)。
PJ34 是一種（ADP-核糖）聚合酶 （PARP） 抑制劑，免疫沉淀結(jié)果表明 PJ34 通過阻止 N 蛋白誘導(dǎo)的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的下調(diào)來緩解肺炎，阿那曲唑是一種增強 Dicer 表達的芳香化酶抑制劑，WB結(jié)果表明，阿那曲唑通過促進?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的表達來緩解 SARS-CoV-2 N 蛋白誘導(dǎo)的肺炎。
思路發(fā)散
本研究通過數(shù)據(jù)庫檢索及分子實驗驗證先初步推測SARS-CoV-2 N蛋白的年齡依賴調(diào)控機制與RNAi以及可變剪接相關(guān)，之后通過組學(xué)測序在整體水平上驗證了猜測并進一步細化了調(diào)控方式，之后再通過大量過表達及敲降后對應(yīng)分子在RNA及蛋白水平的定量驗證了結(jié)果，是一個比較經(jīng)典有效的實驗思路，可以在其他實驗中參考。
參考文獻：
Luo YW, Zhou JP, Ji H, Xu D, Zheng A, Wang X, Dai Z, Luo Z, Cao F, Wang XY,Bai Y, Chen D, Chen Y, Wang Q, Yang Y, Zhang X, Chiu S, Peng X, Huang AL, Tang KF. SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia.?Nat Commun. 2024 Aug 13;15(1):6964. doi:10.1038/s41467-024-51192-1.
]]>本期為各位老師帶來一篇關(guān)于小RNA及l(fā)ncRNA研究的高分經(jīng)典案例解讀，希望能為各位老師后續(xù)研究激發(fā)新的研究思路~
中文題目：Klotho衍生肽1通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控恢復(fù)Klotho表達抑制纖維化腎臟細胞衰老
英文題目：Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation[2]
合作單位：南方醫(yī)科大學(xué)
發(fā)表期刊：Theranostics?
影響因子：12.4
百邁客生物為該研究提供了miRNA測序服務(wù)。
研究背景
慢性腎?。–KD）是一種持續(xù) 3 個月以上的腎功能不全病癥，特征通常是細胞衰老增加、表觀遺傳重編程、持續(xù)的成纖維細胞活化和持續(xù)的細胞外基質(zhì)（ECM）產(chǎn)生，與老年腎臟存在很多相似之處，因此，CKD現(xiàn)在被認(rèn)為是一種腎臟過早和加速衰老的狀態(tài)?？顾ダ系鞍?Klotho 屬于由α和β亞型組成的單跨膜蛋白小家族，腎損傷會導(dǎo)致Klotho表達下調(diào)，Klotho 缺乏可導(dǎo)致高磷血癥、腎小管細胞衰老和腎纖維化等，進一步加速 CKD的進展，因此Klotho 被認(rèn)為是腎臟疾病診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點。
然而由于Klotho 是一種大型跨膜蛋白，臨床生產(chǎn)成本高且難度大，因此作者團隊在前期報道了Klotho衍生肽1（KP1） 的發(fā)現(xiàn)，可通過結(jié)合TGF-β 受體2（TβR2） 并抑制 TGF-β/Smad3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來減輕腎纖維化，且生產(chǎn)上會更便捷經(jīng)濟，有可能替代 Klotho 進行臨床轉(zhuǎn)化，為了進一步研究 KP1 在保護腎臟中的作用，作者在本篇研究中檢查了其對細胞衰老的影響。
材料方法
材料：8-10周齡雄性C57BL/6小鼠假手術(shù)組（sham）、單側(cè)缺血再灌注損傷（UIRI）組別小鼠和治療組別小鼠（UIRI + KP1）共三組小鼠腎臟組織；
方法：miRNA測序+雙熒光素酶報告基因檢測+RNA 熒光原位雜交等
研究結(jié)果
WB檢測了許多細胞衰老標(biāo)志物如p21、p16和γ-H2AX的表達，結(jié)果表明了UIRI 誘導(dǎo)纖維化腎中對應(yīng)標(biāo)志物的表達，而KP1明顯消除了這種誘導(dǎo)。此外針對其內(nèi)源Klotho 的檢測也證明UIRI 導(dǎo)致腎臟中Klotho 的丟失而KP1在很大程度上恢復(fù)了它們的表達，單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）誘導(dǎo)的 CKD 模型以及體外細胞模型中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，此外，UIRI 還導(dǎo)致 Klotho mRNA 的顯著下調(diào)。然而，KP1 不影響 Klotho mRNA 的穩(wěn)態(tài)水平，說明KP1通過獨立于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制誘導(dǎo) Klotho。
此外，通過流式細胞術(shù)進行的細胞周期分析表明，TGF-β1 孵育后的衰老原代腎小管細胞停滯在 G1 期，這被 KP1 處理抵消，證明了KP1阻斷細胞衰老的能力，而在可以阻斷新mRNA合成的放線菌素D（ActD）存在下與 TGF-β1 孵育后 12 小時和 24 小時，KP1 不會影響 Klotho mRNA 水平，進一步證實了 KP1 誘導(dǎo) Klotho 蛋白表達而不影響其mRNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。
由于 KP1 不影響 Klotho mRNA 水平和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，作者開始探索 KP1 是否通過miRNA調(diào)節(jié) Klotho 蛋白，在 UIRI 腎臟中鑒定到了68個上調(diào)miRNA，在注射 KP1 后恢復(fù)到基線，其中 10 個與 Klotho mRNA 的 3′-UTR 特異性結(jié)合，其中miR-223-3p表現(xiàn)非常明顯，且在對公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分析后發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p 與 Klotho 水平呈負相關(guān)，支持了 miR-223-3p 與 Klotho 調(diào)節(jié)的相關(guān)性。
為了證實 miR-223-3p 在 Klotho 表達中的調(diào)節(jié)作用，作者進行了雙熒光素酶報告基因測定，轉(zhuǎn)染 miR-223-3p 模擬物降低了含有野生型未突變型 Klotho mRNA 序列的報告基因的熒光素酶活性，表明 miR-223-3p 可以特異性靶向 Klotho mRNA，抑制其活性，用miR-223-3p轉(zhuǎn)染HK-2細胞進一步證明miR-223-3p抑制 HK-2 細胞中 Klotho 蛋白的表達。體內(nèi)模型原位雜交驗證了miR-223-3p 在 UIRI 腎腎小管上皮中被誘導(dǎo)，而KP1抑制了miR-223-3p表達，結(jié)合免疫熒光染色結(jié)果證明了KP1 可以通過在體內(nèi)抑制 miR-223-3p 來恢復(fù) Klotho 表達，在體外的HK-2 細胞中的miR-223-3p及其拮抗劑轉(zhuǎn)染實驗也呈現(xiàn)出了相同的結(jié)果。
為了進一步驗證實驗結(jié)果，作者對小鼠模型靜脈注釋miR-223-3p 表達質(zhì)粒和 KP1構(gòu)建體內(nèi)表達模型，結(jié)果顯示，miR-223-3p 的過表達加劇了 p16 、 γ-H2AX 、纖連蛋白、 I 型膠原和 α-SMA 的表達，所有這些都被 KP1 抑制，而miR-223-3p拮抗素的注射同樣消除了 UIRI 小鼠中的 p21、p16 和 γ-H2AX、纖連蛋白、膠原蛋白 I 和 α-SMA，恢復(fù)了腎功能。而 KP1、SB431542 （TβR1/2 抑制劑） 和 SIS3 （p-Smad3 抑制劑） 處理 TGF-β1 刺激的 HK-2 細胞結(jié)果進一步闡明了，KP1 通過阻斷 TGF-β1/Smad3/miR-223-3p 信號傳導(dǎo)來恢復(fù) Klotho 表達并防止細胞衰老。
由于 miRNAs 和 lncRNAs 經(jīng)常相互作用并相互調(diào)節(jié)，作者搜索了幾個 lncRNA-miRNA 相互作用數(shù)據(jù)庫，并預(yù)測 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 （?；撬嵘险{(diào)基因 1） 具有推定的結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因測定驗證了miR-223-3p 降低了野生型TUG1報告基因的熒光素酶活性，且在 HK-2 細胞中過表達 miR-223-3p 抑制了 lncRNA-TUG1，而KP1則消除了這個效果，TGF-β1抑制了HK-2細胞中l(wèi)ncRNA-TUG1的表達，而KP1、SB43154或SIS3則消除了此類效果，這些結(jié)果表明lncRNA-TUG1受TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。而LncRNA-TUG1 沉默也降低了 Klotho 蛋白，但沒有降低其 mRNA 水平，說明miR-223-3p 可以與 lncRNA-TUG1 相互作用，形成競爭性內(nèi)源性 RNA （ceRNA） 網(wǎng)絡(luò)，從而放大其在調(diào)節(jié) Klotho 表達和細胞衰老中的作用。體內(nèi)UUO和UIRI 模型中都驗證了這一點。
綜上所述，miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 協(xié)同工作，導(dǎo)致 Klotho 丟失、細胞衰老和腎纖維化，所有這些都被 KP1 緩解。KP1 是一種新發(fā)現(xiàn)的 Klotho 衍生肽，通過恢復(fù) Klotho 表達來抑制細胞衰老，KP1 的這種作用由 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)運作。通過恢復(fù) Klotho 表達，KP1 充當(dāng) Klotho 誘導(dǎo)劑，并具有廣泛的腎保護特性，例如抗氧化、抗衰老和干細胞保護，有望將KP1轉(zhuǎn)化為 CKD 患者的臨床治療。
思路發(fā)散
本研究中利用miRNA測序、公共lncRNA數(shù)據(jù)庫以及公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集共同分析出了miRNA與lncRNA共同構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達的作用機制，對于較新的研究來說，可以直接通過全轉(zhuǎn)錄組，利用同一來源組織構(gòu)建兩個文庫（lncRNA及小RNA文庫）得到包括lncRNA、miRNA、mRNA以及circRNA的結(jié)果，由此可分析出更可靠的相關(guān)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，便于篩選關(guān)鍵非編碼RNA。
參考文獻：
[1] Chen LL, Kim VN. Small and long non-coding RNAs: Past, present, and future.Cell. 2024 Nov 14;187(23):6451-6485. doi: 10.1016/j.cell.2024.10.024. PMID:39547208.
[2] Zhang X, Li L, Tan H, Hong X, Yuan Q, Hou FF, Zhou L, Liu Y. Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation. Theranostics. 2024 Jan 1;14(1):420-435. doi: 10.7150/thno.89105. PMID: 38164143; PMCID: PMC10750200.
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期刊名稱：cell proliferation.
影響因子：5.9
合作單位：中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院
研究部位：大鼠胚胎
研究方法：空間轉(zhuǎn)錄組、免疫熒光、CCK-8、WB、ROS檢測等
百邁客生物為該研究提供了空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。
研究背景
肛門直腸畸形 （ARM） 是兒童常見的先天性消化道畸形，發(fā)病率為 1/5000。ARM 的病因仍然難以捉摸，其發(fā)病機制與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。最近的研究強調(diào)了遺傳調(diào)控在這一過程中的關(guān)鍵作用。ARM 通常發(fā)生在妊娠 4-8 周，主要在出生后診斷，通常需要手術(shù)干預(yù)作為治療。然而，ARM 患者的長期術(shù)后結(jié)局并不理想，通常會導(dǎo)致并發(fā)癥，例如大便失禁和慢性便秘。這些并發(fā)癥對受影響兒童的生活質(zhì)量和社會心理發(fā)展有重大影響。作者的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析確定了鐵死亡的發(fā)生，這是一種鐵依賴性的程序性細胞死亡，其特征是活性氧 （ROS） 和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在 ARM 后腸內(nèi)積累。作者假設(shè)這個過程受活化 C 激酶受體 1 （Rack1） 的調(diào)節(jié)，細胞質(zhì)蛋白與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白有相似之處。它在細胞生長、分化、信號傳導(dǎo)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著多種作用，并且在胚胎神經(jīng)發(fā)育中具有潛在的意義。然而，以前的研究沒有報道 Rack1 在鐵死亡調(diào)節(jié)中的作用。因此，它在胚胎消化道發(fā)育和 ARM 形成中的作用需要進一步探索。
材料方法
使用Wistar 大鼠，在 ARM 組中，大鼠在 GD 10開始口服 1% ETU 125 mL/kg，對照組接受等劑量生理鹽水。從 GDs 14-16取胚胎。
1、空間轉(zhuǎn)錄組測序剖宮產(chǎn)后，立即將取出的胚胎置于冷生理鹽水中以去除表面血。將胚胎以水平矢狀方向放置在含有預(yù)冷OCT的包埋盒中儲存在 -80°C 冰箱中。共計6份樣品，切片包括尿道和后腸層。2、免疫熒光
選擇清晰全面顯示尿道、后腸、URS 和尿道回瘺的石蠟切片進行染色。
研究結(jié)果
1.空間轉(zhuǎn)錄組測序的注釋聚類
在這項研究中，作者在 GDs 14-16 （稱為 N14-16） 上使用正常的 Wistar 大鼠胚胎，在 GDs 14-16 （稱為 A14-16） 上使用 ETU 誘導(dǎo)的 ARM 胚胎進行空間轉(zhuǎn)錄組測序。制備大鼠胚胎的 6 個冷凍中矢狀切片，每個 10 μm 厚。這些切片包括尿道和后腸層，提供了特定時間點泄殖腔發(fā)育的全面視圖（圖 1A）。使用 10× Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，然后進行組織透化、cDNA 合成和文庫構(gòu)建，作者成功地捕獲了正常和 ARM 胚胎中的視覺基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，主要來自泄殖腔區(qū)域。為了確保來自同一區(qū)域的各種切片樣本之間的可比性和一致性，作者進行了聚類注釋，產(chǎn)生了七個不同的聚類。這些集群包括泄殖腔區(qū)域內(nèi)的五個特定區(qū)域（集群 0-4），即尿道、后腸、膀胱、URS 和生殖器結(jié)節(jié)。此外，兩個簇 （簇 5 和 6） 對應(yīng)于椎體和神經(jīng)管區(qū)域 （圖 1A）。平均而言，每個解剖區(qū)域覆蓋 3005 個點，每個點捕獲 16,905 個基因（圖 1B）。
圖1-空間轉(zhuǎn)錄組測序的注釋聚類
2.正常組和 ARM 組之間的 DEG 篩選
鑒定 DEG 的標(biāo)準(zhǔn)被確定為絕對對數(shù)2 倍變化 （|log2FC|） ≥ 0.58 且顯著性水平為 p< 0.05. 這種篩選導(dǎo)致了差異火山圖的創(chuàng)建，以說明基因表達的改變。在 GDs 14、15 和 16 的后腸發(fā)育背景下，作者分別鑒定了 91、439 和 119 個基因，它們在這些時間點表現(xiàn)出不同的表達譜（圖 1C）。值得注意的是，Rack1 （Gnb2l1） 在 GDs 15 和 16 上在 ARM 組后腸內(nèi)的表達降低。為了進一步探索潛在的分子相互作用，作者進行了全面的 PPI 分析。通過利用 BC 值作為排名標(biāo)準(zhǔn)，作者突出了最顯著的差異表達后腸基因（圖 1D）。樞紐基因，在環(huán)狀排列中用粉紅色節(jié)點表示，包括 Uba52、Rack1 和 Tpt1，在后腸發(fā)育的 GDs 15 和 16 期間，每個基因在基因網(wǎng)絡(luò)中都具有顯著的中心性。值得注意的是，Rack1 表現(xiàn)出卓越的連通性，在 GD 15 和 16 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)中躋身前五名基因之列。
3.在 GD 15 上驗證后腸部分 DEGs
圖 2A-E 全面說明了 GD15 截面泄殖腔區(qū)域中前五個基因的蛋白質(zhì)表達模式和定位：Rack1、Npm1、Eef1b2、Uba52?和?Tpt1。這些數(shù)字是使用免疫熒光染色獲得的。值得注意的是，這 5 種蛋白質(zhì)在 N15 泄殖腔區(qū)域的尿道和后腸上皮內(nèi)均表現(xiàn)出位點特異性表達。除?Tpt1?外，其他 4 種蛋白在 AM 區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出表達水平升高。此外，觀察到這些蛋白質(zhì)離散分布在 URS 的下肢和后腸的間質(zhì)附近。相比之下，這五種蛋白的表達在 A15 泄殖腔區(qū)域的尿道和后腸上皮內(nèi)明顯下降，伴隨著尿道直瘺部位的表達水平降低 （p < 0.05）。圖 2F 顯示了平均光密度 （AOD） 的半定量評估，特別是在后腸結(jié)構(gòu)域內(nèi)。
圖2-在 GD 15 上驗證后腸部分 DEGs
4.PROGENy 算法預(yù)測后腸中 MAPK 信號通路的集中富集
PROGENy 算法用于通過下游基因表達的變化評估信號通路的活性。作者獲得了正常組和 ARM 組 GDs 14-16 樣本中不同通路的活性水平評分。在使用 NNMF 對后腸區(qū)域（N14 因子 16、A14 因子 15、N15 因子 15、A15 因子 20、N16 因子 18 和 A16 因子 10）進行聚類分析中，PROGENy 算法顯示與 MAPK 信號通路呈強正相關(guān)，表明 MAPK 信號在后腸中顯著富集（圖 3A)。從這些區(qū)域提取來自 Erk、P38、JNK 和 Erk5 家族的 12 個成員分子的定位表達模式。具體來說，Mapk3 、 Mapk6 和 Mapk14 主要富集在泄殖腔區(qū)域。這些蛋白質(zhì)的免疫熒光驗證證實了它們在尿道和后腸區(qū)域的特異性表達，在 URS 和間質(zhì)區(qū)域的表達相對較弱，這與 PROGENy 預(yù)測一致（圖 3B）。
圖3-PROGENy 算法預(yù)測后腸中 MAPK 信號通路的集中富集用
5.通過細胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時空表達模式
在基因集富集分析（GSEA）數(shù)據(jù)庫中，細胞死亡基因集包含161個基因，其中 7 個細胞死亡相關(guān)基因是從基因集與GD 15上簇1中的 DEGs 交集中獲得的（圖 4A）。圓形熱圖顯示了與聚類1的6個樣本相同區(qū)域內(nèi)的細胞死亡基因的表達譜。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過氧化物酶家族的關(guān)鍵成員?Gpx4?在 GD 15 的簇 1 中下調(diào)（p < 0.05；圖 4B）。免疫熒光染色顯示 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮以及 AM 區(qū)域的顯著定位，在 URS 中觀察到的分布相對較淺。在 ARM 組的泄殖腔中觀察到 Gpx4 陽性信號的減少（圖 4C）。AOD 分析表明，在 GDs 15 和 16 上，后腸中 Gpx4 表達在統(tǒng)計學(xué)上顯著降低（p < 0.05;圖 4D）。
圖4-通過細胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時空表達模式
6.PD-L2 過表達抑制腫瘤細胞凋亡并促進對 EGFR-TKI 的耐藥
N15 胚胎石蠟切片的雙免疫熒光染色顯示 Rack1 和 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮內(nèi)共定位。該結(jié)果表明 Rack1 在調(diào)節(jié)這些組織中的鐵死亡中的潛在作用 （圖 4E）。隨后，進行顯微解剖以獲得正常和 ARM 胚胎的后腸組織。透射電子顯微鏡 （TEM） 顯示 ARM 組細胞線粒體體積減小，線粒體密度增加，線粒體嵴減少。這些觀察結(jié)果與與鐵死亡發(fā)生相關(guān)的線粒體形態(tài)變化一致（圖 4F）。
7.Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時空表達譜
之前描述了 Rack1 蛋白在 GD 15 泄殖腔區(qū)的定位（圖 2A），作者進一步研究了它在 GDs 14 和 16 泄殖腔區(qū)的定位。在正常胚胎 （N14） 中，Rack1 陽性信號主要在尿道和后腸的上皮細胞中觀察到，后腸遠端的濃度較高。這些信號也分散在 URS 和間充質(zhì)細胞內(nèi)。在 ARM 胚胎 （A14） 中，在 URS 尖端、后腸和尿道上皮觀察到 Rack1 陽性細胞（圖 5A）。比較分析顯示，N14 和 A14 組之間 Rack1 陽性信號的 AOD 沒有顯著差異（圖 5B）。在 GD 16 （N16） 的正常大鼠胚胎中，Rack1 表達在尿道和后腸上皮中仍然突出，但在 URS 和周圍間充質(zhì)區(qū)域受到限制（圖 5A）。值得注意的是，A16 后腸區(qū)域的熒光強度降低 （p < 0.05），如圖 5B 所示，這說明了后腸區(qū)域的半定量 AOD 結(jié)果。
圖5-Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時空表達譜
8.敲低 Rack1 誘導(dǎo)腸上皮細胞鐵死亡
在 IEC-6 細胞中轉(zhuǎn)染 si-Rack1 后，使用 TEM 觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。si-Rack1 組表現(xiàn)出完整的細胞和核膜，線粒體大小減小，線粒體密度增加。此外，線粒體嵴減少或不存在，類似于 erastin 處理后觀察到的特征（圖 5C）。如 CCK-8 測定中觀察到的 Rack1 敲低導(dǎo)致細胞活力降低，LDH 測定所示，細胞毒性增加（p < 0.05；圖 5D）。使用 FerroOrange 探針的熒光分析表明 si-Rack1 組細胞內(nèi)亞鐵離子濃度升高，在 Fer-1 處理后降低（p < 0.05；圖 5E）。使用 DCFH-DA 探針測量細胞內(nèi) ROS 水平顯示 si-Rack1 組的 ROS 水平較高，在 Fer-1 處理后下降（p < 0.05；圖 5F）。Liperfluo 探針評估揭示了 Fer-1 能夠減輕 si-Rack1 組中升高的脂質(zhì)過氧化物水平 （p < 0.05；圖 5G）。熒光強度定量結(jié)果如右圖所示。
9.Rack1 敲低可增強 P38 磷酸化并調(diào)節(jié)下游 Nqo1/Gpx4 表達
如前所述，MAPK 信號通路在后腸區(qū)域顯著富集（圖 3A）。在 IEC-6 細胞中轉(zhuǎn)染 si-Rack1 后，使用 MAPK 信號通路 PCR 陣列在 mRNA 水平上鑒定受 Rack1 影響的下游分子。使用閾值 |log2FC|≥ 2 和 p < 0.05 用于 PCR 陣列差異基因篩選，作者觀察到 si-Rack1 組中 P38δ （Mapk13 encoding） 的統(tǒng)計學(xué)顯著升高（圖 6A、B）。Western blot 分析顯示，Rack1 敲低后磷酸化 P38 水平增加（圖 6C、D），表明對 Rack1 的干擾增強了 P38 磷酸化，從而激活了 IEC-6 細胞中的 P38-MAPK 信號通路。隨后，使用鐵死亡 PCR 陣列篩選 si-Rack1 和 doramapimod 處理組之間表現(xiàn)出 mRNA 水平變化的基因，揭示了總共 7 個基因（圖 6E）。此外，這 7 個基因的表達豐度數(shù)據(jù)與現(xiàn)有研究報告相結(jié)合，將 Nqo1 確定為下游分子，以供進一步研究。Western blotting 分析顯示，doramapimod 處理逆轉(zhuǎn)了 Rack1 敲除誘導(dǎo)的 Nqo1 蛋白水平降低（圖 6F）。此外，在 si-Rack1 組中觀察到的 Gpx4 降低被 doramapimod 抑制，并通過 2-HBA 處理恢復(fù)（圖 6G）。
圖6-Rack1 敲低可增強 P38 磷酸化并調(diào)節(jié)下游 Nqo1/Gpx4 表達
10.Rack1?通過 P38 和 Nqo1 介導(dǎo)腸上皮細胞中的鐵死亡
在 IEC-6 細胞敲低 Rack1 的同時，使用 doramapimod 和 2-HBA 進行拯救實驗。結(jié)果顯示，與單獨的 Rack1 敲低相比，添加 doramapimod 和 2-HBA 導(dǎo)致細胞活力增加和相對 LDH 含量降低 （p < 0.05；圖 6H，I）。此外，在添加 doramapimod 和 2-HBA 后，細胞內(nèi)亞鐵離子濃度降低，同時 ROS 和脂質(zhì)過氧化水平降低（p < 0.05；圖 6J-L）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Rack1 通過P38信號通路和 Nqo1 調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鐵含量和脂質(zhì)過氧化，從而介導(dǎo)腸上皮細胞的鐵死亡。
研究總結(jié)
本研究利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對 GDs 14-16 期間的正常和 ARM 大鼠胚胎樣本進行測序。作者在后腸區(qū)域鑒定了具有高連接性的新樞紐基因，即?Rack1 、 Uba52 、 Tpt1 、 Npm1?和?Eef1b2。相比之下，作者觀察到 MAPK 信號通路的顯著富集和 Gpx4 在后腸區(qū)域的差異表達。值得注意的是，Rack1?在 GDs 15 和 16 的 ARM 后腸中表達降低，通過 P38/Nqo1/Gpx4 軸升高細胞內(nèi)鐵、ROS 和脂質(zhì)過氧化水平，最終誘導(dǎo)腸上皮細胞鐵死亡，并可能影響 ARM 后腸發(fā)育。這些發(fā)現(xiàn)增強了作者對 ARM 發(fā)病機制的理解，并對推進 ARM 產(chǎn)前診斷和治療策略的研究具有重要意義。
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文章標(biāo)題：Molecular and spatial signatures of human and rat corpus cavernosum physiopathological processes at single-cell resolution研究背景
陰莖勃起是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，整個過程需要神經(jīng)、內(nèi)分泌、血管和陰莖海綿體組織精密調(diào)節(jié)、協(xié)調(diào)完成。海綿體損傷可引起多種疾病，包括影響了5%~22%男性的陰莖勃起功能障礙（ED）。
ED不僅影響患者身心健康以及家庭和諧，還可能是心血管疾病的先兆。雖然目前已經(jīng)知道在勃起發(fā)生和維持中不同功能區(qū)域的作用，但以往研究大多都依賴于解剖觀察、影像學(xué)檢查，以及少數(shù)基因或蛋白質(zhì)的表達模式分析，缺乏全面的分子水平分析。
此外，多數(shù)ED相關(guān)研究是基于大鼠模型的，但當(dāng)前對于大鼠和人類間陰莖海綿體（CC）的解剖學(xué)和信號網(wǎng)絡(luò)差異認(rèn)識尚不清晰。因此，為了更好的使用大鼠模型開展研究，有必要深入研究大鼠陰莖海綿體的結(jié)構(gòu)/功能調(diào)控與人類的異同。
材料方法
研究材料：4例陰莖癌患者，3例健康志愿者，10例DMED（糖尿病性勃起功能障礙）患者；4只健康大鼠，6只DMED大鼠模型。
研究方法：Masson/H&E染色（n=7），scRNA-seq（n=12，3例健康人類CC/3例DMED人類CC，3例健康大鼠CC/3例DMED大鼠CC），空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（BMKS1000，n=3，1例陰莖腫瘤患者、1例勃起功能正常雄性大鼠以及1例DMED模型大鼠）等。
驗證實驗：包括油紅O/尼羅紅/菲律賓鏈霉菌染色、不同硬度ECM條件下培養(yǎng)的FB細胞形態(tài)信息及bulk RNA-seq數(shù)據(jù)、免疫熒光、超聲彈性成像。
研究結(jié)果
1.人類和大鼠CC細胞和空間特征
通過scRNA-seq數(shù)據(jù)，研究者在人類CC（陰莖海綿體）中鑒定出7種類型細胞，僅在大鼠CC中發(fā)現(xiàn)一小部分中性粒細胞和B細胞。使用scRNA-seq數(shù)據(jù)對空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行注釋（CellTrek），研究者得到了人類和大鼠CC樣本空間細胞分布圖譜（level3，20μm分辨度），發(fā)現(xiàn)雖然人類和大鼠CC中的細胞類型相似，但每種類型細胞比例、空間分布特征存在異質(zhì)性。
圖1-通過scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)得到的人類，以及正常/DMED條件下大鼠的CC細胞全局表達譜
2.人類和大鼠CC組織中的空間異質(zhì)性
作為一種特殊的血管竇結(jié)構(gòu)，當(dāng)前已初步認(rèn)識到CC上不同區(qū)域的類型不同。得益于空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，研究者發(fā)現(xiàn)人類CC組織中SVG（空間差異基因）top（如CCL18、PLA2G2A、C3）主要在不同類型細胞中表達，但有一些表現(xiàn)出空間分布特異性的基因并沒有在scRNA-seq數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出細胞類型特異性；人類CC組織3個代表性區(qū)域中，不同區(qū)域的細胞比例不同，如區(qū)域I（海綿體動脈區(qū)域）EC（內(nèi)皮細胞）占比更高，而區(qū)域III（白膜附近區(qū)域）包含更少的FB（成纖維細胞）但SMC（平滑肌細胞）豐富。大鼠CC組織也表現(xiàn)出相似的情況（大鼠CC中缺乏梳狀中隔和明顯的海綿體動脈，研究者根據(jù)人類CC代表性區(qū)域的空間位置，在大鼠CC中也劃分出可比較的3個代表性區(qū)域）。
圖2-人類CC組織的轉(zhuǎn)錄特征和空間異質(zhì)性
3.根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)比較人類和大鼠CC中的細胞類型
多數(shù)勃起調(diào)控研究是基于大鼠模型的。為了理解大鼠和人類間CC微環(huán)境的異同，研究者通過分析scRNA-seq數(shù)據(jù)中的人—大鼠同源基因，發(fā)現(xiàn)雖然人類和大鼠物種不同，但CC中相同類型細胞仍可以聚成同一簇，進一步分析發(fā)現(xiàn)人類和大鼠CC中相同類型細胞的轉(zhuǎn)錄相似性>70%且正相關(guān)，表明在多數(shù)情況下，使用大鼠模型模擬、研究人類CC微環(huán)境的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是可接受的。然而，人類和大鼠CC中相同類型細胞的DEGs（差異表達基因）top并不一致，提示當(dāng)研究者更關(guān)注一個或幾個基因或通路時，使用大鼠模型要特別注意。
附錄圖7-scRNA-seq數(shù)據(jù)評估得到的大鼠和人類CC間相似性和差異性
4.比較人類和大鼠CC空間轉(zhuǎn)錄組全局
通過分析空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的人—鼠同源基因，研究者找到人類和大鼠共有的459個top SVG，大多數(shù)SVG并不是細胞類型特異的，其中EC、FB和SMC是表達這些SVG最多的3種類型細胞。富集分析結(jié)果顯示，基礎(chǔ)生物學(xué)過程如“translational initiation”、“extracellular structure organization”以及“protein targeting”，在人類和大鼠CC組織的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中是保守的；人類特異SVG主要與炎癥響應(yīng)有關(guān)，而這些SVG的大鼠同源基因主要與代謝過程有關(guān)。
圖3-比較大鼠和人類CC微環(huán)境中的空間差異基因和信號通路
5.人類和大鼠CC微環(huán)境中的細胞—細胞互作分析
為了研究、比較人類和大鼠間CC微環(huán)境的復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)，研究者使用scRNA-seq數(shù)據(jù)進行CellChat分析，發(fā)現(xiàn)大鼠CC中的細胞互作數(shù)量雖然小于人類，但細胞互作強度是相似的?；谶@些互作的表達模式，研究者進行簡單的分類，發(fā)現(xiàn)雖然胞外基質(zhì)相關(guān)的互作整體強度與細胞類型間配體-受體強度相當(dāng)，但兩者基因組成是有差異的；血管生成相關(guān)的互作整體強度在人類和大鼠中沒有差異，但基因組成存在差異，如大鼠CC微環(huán)境中是主要是VEGFB表達，而人類CC微環(huán)境中高表達的是VEGFA和IGF1。
空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，VEGF配體主要集中富集在人類CC中的海綿體動脈（區(qū)域I）附近，而在蛋白質(zhì)水平，VEGFA和IGF1并不共定位。大鼠中VEGF和IGF基因的空間分布模式與人類的相似，但蛋白質(zhì)水平上區(qū)域I中存在高濃度的VEGFA和IGF1。此外，免疫相關(guān)的互作在人類CC與大鼠CC中表現(xiàn)出相似或者更高的整體信息流，但一些配體亞型在大鼠中高表達。
這些scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析結(jié)果與基于空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)SVG的富集分析結(jié)果高度一致。
圖4-配體-受體對分析顯示人類和大鼠CC組織中的細胞—細胞通訊
6.EC表現(xiàn)出顯著的空間異質(zhì)性和物種差異
根據(jù)以往的解剖觀察以及scRNA-seq數(shù)據(jù)分析，可知CC中包含3種類型EC（內(nèi)皮細胞），包括GJA5+ EC（動脈內(nèi)皮細胞）、SELP+ EC（靜脈內(nèi)皮細胞）以及KIT+ EC（海綿體竇內(nèi)皮細胞）。人類CC中GJA5+ EC占比最低，主要分布在海綿體動脈區(qū)域；SELP+ EC主要分布在白膜區(qū)域；KIT+ EC廣泛分布。但大鼠CC中，Selp+ EC比例更高，Gja5和Kit可能并不是有用的靜脈和CC內(nèi)皮細胞標(biāo)志物?；趕cRNA-seq數(shù)據(jù)進行GO分析，研究者發(fā)現(xiàn)不同類型EC富集了不同功能，多數(shù)細胞類型特異性的term（條目）在人類CC中并沒有空間分布異質(zhì)性，但一些特殊term在大鼠CC中表現(xiàn)出空間分布異質(zhì)性。
附錄圖10-人類和大鼠EC簇間的物種相似性和異質(zhì)性
7.SMC表現(xiàn)出顯著的空間異質(zhì)性和物種差異
根據(jù)以往研究結(jié)果，研究者將CC中的SMC（平滑肌細胞）簇分為VSMC（血管平滑肌細胞）和CCSMC（海綿體小梁平滑肌細胞）。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，兩種類型SMC在物種間存在顯著差異，其中人類CCSMC高表達DES，VSMC高表達RGS5；大鼠CCMS和VSMC可通過Igfbp2和Rgs5區(qū)分；蛋白質(zhì)水平上，CCSMC與VSMC不同，后者不表達肌動蛋白或肌球蛋白；根據(jù)SMC的SVG空間分布模式，發(fā)現(xiàn)ACTC1/Actc1只在人類CCSMC中表達；前期研究發(fā)現(xiàn)ADRA2A在人VSMC表達，ADRA2C在人CCSMC中表達，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也驗證了這一發(fā)現(xiàn)，但大鼠CC中Adra2a并沒有表現(xiàn)出細胞類型特異性而Adra2c的表達未檢測到，提示在這個方面大鼠并不是合適的研究模型。
圖5-人類和大鼠SMC簇間的物種相似性和異質(zhì)性
8.人類和大鼠FB有相似的聚類特征和空間分布，但亞型比例不同
近期，CC的FB（成纖維細胞）成為研究熱點，但對其空間和物種異質(zhì)性仍不清楚。研究者根據(jù)PI16、APOE及其他載脂蛋白、COMP的表達情況，將人類CC FB分成3種亞群?？臻g轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，人類CC中3種FB亞群空間分布模式不同，富集的功能也不同；大鼠CC FB表現(xiàn)出與人類CC FB相似的亞群和標(biāo)志基因，但每種亞群的比例與人類顯著不同。
APOE與脂滴轉(zhuǎn)運密切相關(guān)。油紅O染色顯示大鼠CC中脂滴位置與Apo+ FB的空間分布高度一致，且都在白膜下富集；免疫熒光染色結(jié)果顯示大多數(shù)脂滴與APOE蛋白共區(qū)域化出現(xiàn)且在白膜下有更高的富集，特別是在區(qū)域III（左右CC連接區(qū)域）；人類CC中APOE分布特征與大鼠類似但表達更廣泛。
前期研究成果顯示，F(xiàn)B是人類CC中最強的外向信號源，在調(diào)控微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起到重要作用。因而，F(xiàn)B表型轉(zhuǎn)變可能與CC結(jié)構(gòu)和功能變化密切相關(guān)。通路活性分析顯示PI3K通路活性分值與APO+ FB有相似的空間分布模式，而TNF-α和TGF-β的空間分布模式與之相反；空間上CCSMC與FB相距較遠（level13，100μm分辨度分析FB生態(tài)位），而GJA5+ EC、VSMC、SWC（Schwann細胞）和T細胞與COMP+ FB空間距離較近，表明COMP+ FB與神經(jīng)和血管密切相關(guān)；CXCLs、CCN2以及C3與3種FB亞群生態(tài)位正相關(guān)，但CCN5和C7與COMP+ FB生態(tài)位負相關(guān)，GREM1不與PI16+ FB或APO+ FB相關(guān)但與COMP+ FB生態(tài)位顯著正相關(guān)。
圖6-CC中不同成纖維細胞亞群表現(xiàn)出不同的空間分布特征
9.CC中機械力信號存在空間異質(zhì)性，并調(diào)控FB表型轉(zhuǎn)變
以往研究表明病理條件下YAP信號誘導(dǎo)FB-肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)變，但這不能完全解釋生理條件下存在著的多種FB亞型，特別是有高脂質(zhì)代謝活性的APO+ FB。有報道ECM（胞外基質(zhì)）機械力調(diào)控多種細胞類型的脂質(zhì)代謝。
本研究中，研究者發(fā)現(xiàn)COMP+ FB生態(tài)位顯著富集了“integrin-mediated signaling pathway”和“response to mechanical stimulus”term；人和大鼠CC中ECM/細胞組成比例表現(xiàn)出明顯的空間異質(zhì)性；空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和免疫熒光染色結(jié)果類似，靠近陰莖背神經(jīng)血管束的上極區(qū)域顯示出較低的纖維化水平，而遠離背神經(jīng)血管束的顯示出較高的纖維化水平；空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和超聲彈性成像結(jié)果都表明，APO+ FB與更柔軟的組織硬度有關(guān)，而COMP+ FB與更硬的組織有關(guān)；不同胞外基質(zhì)硬度培養(yǎng)下的CC FB形態(tài)不同，bulk RNA-seq數(shù)據(jù)顯示機械應(yīng)激顯著改變了FB的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，一些參與調(diào)控脂質(zhì)代謝的基因與低機械力信號有關(guān)；scRNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示APO+ FB分值隨組織硬度增加而降低，COMP+ FB分值隨組織硬度增加而增加；染色結(jié)果顯示隨著組織硬度增加，F(xiàn)B中的中性脂質(zhì)和膽固醇累積降低。
綜上，這些結(jié)果表明機械力信號直接參與調(diào)控FB的表型轉(zhuǎn)變。
圖7-局部機械力信號強度決定了這個區(qū)域內(nèi)成纖維細胞的表型
10.人類和大鼠CC經(jīng)歷了相似的DMED病理變化
為了更好的認(rèn)識DMED病理條件下，人類和大鼠CC微環(huán)境發(fā)生的變化是否與每種CC細胞類型中發(fā)生的分子水平變化相一致，研究者通過分析scRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)DMED大鼠模型和DMED患者都經(jīng)歷了顯著的纖維化以及細胞組分丟失，但兩者間的轉(zhuǎn)錄組差異顯著。富集分析結(jié)果顯示，僅DMED大鼠模型富集了“extracellular structure organization”；“actin cytoskeleton or organization”和“oxidative phosphorylation”僅在人類DMED患者SMC中發(fā)現(xiàn)，“regulation of MARK cascade”僅在DMED大鼠模型SMC中富集；“rhythmic process”僅在人類DMED患者FB中富集，“l(fā)eukocyte activation”僅在DMED大鼠模型FB中富集。
空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示DMED大鼠模型陰莖中，除尿道以外的組織區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達水平整體降低，而scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示DMED狀態(tài)細胞的轉(zhuǎn)錄水平高于正常狀態(tài)的細胞，這或許意味著，可能是由于單位面積上細胞數(shù)量降低，導(dǎo)致空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平降低的現(xiàn)象。
附錄圖13-通過scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組評估DMED條件下CC的病理變化
研究總結(jié)
本文繪制了人類和大鼠陰莖海綿體（CC）的生理、病理條件下的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)比較了兩個物種間的異同。本研究成果為人類、大鼠陰莖海綿體的分子解剖學(xué)，以及跨細胞類型和區(qū)域的信號網(wǎng)絡(luò)提供了清晰洞見。同時在分子水平比較了人類和大鼠的陰莖海綿體異同，為理解動物模型的可用性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，推動臨床前實驗和臨床轉(zhuǎn)化更高效、可靠。文中還闡述了CC中機械力信號的空間分布異質(zhì)性，并確認(rèn)ECM機械信號可以調(diào)節(jié)FB表型轉(zhuǎn)變，提出靶向APO+ FB或可成為未來治療DMED的有效手段。最后，研究者也明確指出了本文中研究的局限性，為后續(xù)研究指明了方向。
參考文獻：
Yin et al, Molecular and spatial signatures of human and rat corpus cavernosum physiopathological processes at single-cell resolution. Cell Rep. 2024 Sep 24;43(9):114760. doi: 10.1016/j.celrep.2024.114760. Epub 2024 Sep 18.
研究背景
表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑 （EGFR-TKI） 是癌癥靶向治療的經(jīng)典例子。已獲批的 EGFR-TKIs 單獨使用或與化療聯(lián)合用于治療非小細胞肺癌 （NSCLC）、結(jié)直腸癌 （CRC）、乳腺癌 （BC） 等。然而，大多數(shù)患者在 1-2 年后對 EGFR-TKI 產(chǎn)生獲得性耐藥，隨后癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。為了解決這一緊迫的臨床問題，迫切需要延遲和克服 EGFR-TKIs 耐藥的策略。到目前為止，獲得性 EGFR 突變、MET 擴增、ERBB2 擴增和旁路激活等作為 EGFR-TKI 耐藥的機制已得到充分研究。近年來，一些研究人員開始關(guān)注腫瘤免疫環(huán)境狀態(tài)與 EGFR-TKIs 治療療效之間的關(guān)系。臨床研究最近發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKIs 治療可以重塑腫瘤免疫環(huán)境，但 EGFR-TKIs 與瘤周免疫細胞之間的關(guān)系尚未得到充分研究。
實驗材料
使用攜帶 EGFR 突變的小鼠細胞系建立了異位異種移植腫瘤模型，并評估了對不同代 EGFR-TKI 的反應(yīng)，揭示腫瘤耐藥機制。
進行天然小分子化合物庫 （MCE） 的篩選，制作了 266 個樣品。篩選 PD-1/PD-L2 結(jié)合抑制劑。
研究結(jié)果
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腫瘤免疫環(huán)境參與腫瘤對 EGFR-TKIs 的耐藥性
首先，該研究使用攜帶 EGFR 突變的小鼠細胞系建立了異位異種移植腫瘤模型，并評估了對不同代 EGFR-TKI 的反應(yīng)。EGFR 突變或擴增存在于多種癌癥中，如非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等。EGFR-TKIs 可以靶向 EGFR 敏感突變。因此，作者使用小鼠肺腺癌細胞 （LLC） 和結(jié)直腸癌細胞 （CT26） 作為工具細胞。作者用突變形式的人 EGFR 轉(zhuǎn)染小鼠細胞系 （LLC 和 CT26），攜帶外顯子 19 缺失 （EGFR19del） 或外顯子 21 L858R 錯義突變 （EGFRL858R），這會增加 EGFR 活性，以接近細胞模型到人類疾病，建立同基因荷瘤小鼠模型。在轉(zhuǎn)染 EGFR 突變體的細胞中，p-EGFR 和 p-ERK1/2 的表達增強，增殖速率顯著增加，表明細胞 EGFR 下游信號通路激活（圖 1A、B）。正如預(yù)期的那樣，EGFR 突變細胞對不同代 EGFR-TKI 更敏感，包括厄洛替尼、阿法替尼和奧希替尼（圖 1B）。為了全面探討 EGFR-TKIs 耐藥的機制，作者使用 EGFR 突變細胞建立了第一代和第三代 EGFR-TKIs 耐藥同基因小鼠模型（圖1C）。如圖1 D所示，第一代 （P1） LLC-EGFR19del 來源的腫瘤對奧希替尼敏感 （抑制率 = 44.0%）。在第 2 代 （P2） 中，作者將奧希替尼的劑量增加了一倍，腫瘤抑制率降低了一半 （22.2%）。用奧希替尼治療的第三代 （P3） LLC-EGFR19del衍生腫瘤被認(rèn)為對奧希替尼耐藥，因為它們的體積與用生理鹽水治療的小鼠的體積沒有顯著差異。同時，作者還使用類似的方法成功獲得了對奧希替尼耐藥的 LLC-EGFRL858R衍生腫瘤和對厄洛替尼耐藥的 CT26-EGFR19del衍生腫瘤（圖 1D）。
為了進一步研究 EGFR-TKIs 耐藥與腫瘤免疫微環(huán)境之間的關(guān)系，作者將 P3 CT26-EGFR19del衍生的腫瘤接種到免疫功能正常的 BALB/c 小鼠和嚴(yán)重免疫缺陷的 NOD （PRKDCKO?IL2RKO） 小鼠中，然后作者評估了它們對厄洛替尼的反應(yīng)性（圖 1E）。作者的結(jié)果表明，接種到 BALB/c 小鼠中的腫瘤對厄洛替尼治療保持耐藥性（抑制率 = 6.9%），而接種到 NOD （PRKDCKO?IL2RKO） 小鼠中的腫瘤顯示出降低的耐藥性（抑制率 = 40.2%）（圖1E）。與體內(nèi)腫瘤生長數(shù)據(jù)一致，增殖生物標(biāo)志物 Ki67 的表達在用厄洛替尼處理后也顯示免疫缺陷異種移植腫瘤組織顯著減少，但在免疫活性異種移植腫瘤組織中沒有減少（圖 1F）?？傊@些結(jié)果表明腫瘤免疫環(huán)境參與 EGFR 突變腫瘤對 EGFR-TKI 的耐藥性。
圖1-腫瘤免疫環(huán)境參與腫瘤對 EGFR-TKIs 的耐藥性
- 腫瘤免疫環(huán)境由激活到抑制的動態(tài)變化驅(qū)動 EGFR-TKIs 耐藥
為了了解腫瘤免疫環(huán)境如何參與對 EGFR-TKI 的耐藥性，作者分析了治療過程中不同階段的腫瘤免疫環(huán)境特征（圖 2A）。作者測定了初始 EGFR-TKIs 治療時和耐藥發(fā)展期間 （P1-P3） 腫瘤免疫環(huán)境中腫瘤浸潤白細胞 （TIL） 的密度，其中用鹽水處理的腫瘤細胞作為 CTRL 組，用厄洛替尼或奧希替尼治療的腫瘤細胞作為 TKI 組。流式細胞術(shù)分析的免疫分析顯示，在治療早期，攜帶 EGFR19del?的腫瘤的 EGFR-TKIs 治療誘導(dǎo)腫瘤浸潤白細胞比例增加（圖2B）。然而，當(dāng)荷瘤小鼠對 EGFR-TKI 產(chǎn)生耐藥性時，與 CTRL 組相比，腫瘤浸潤白細胞的比例顯著降低（圖2B）。這表明荷瘤小鼠對 EGFR-TKIs 的反應(yīng)性改變伴隨著腫瘤免疫環(huán)境的動態(tài)變化。
為了準(zhǔn)確反映腫瘤免疫環(huán)境的真實狀態(tài)，作者檢查了藥物治療期間荷瘤小鼠腫瘤免疫環(huán)境中的 T 細胞浸潤和功能。作者觀察到，兩種模型的 P1 荷瘤小鼠中 CD8+?T 細胞比例均顯著增加，但隨著 TKI 治療的繼續(xù)，這種增加消失。TKI 耐藥 P3 荷瘤小鼠中 CD8+?T 細胞的比例顯著降低（圖2C）。因此，作者假設(shè) T 淋巴細胞，尤其是 CD8+?T 細胞，從最初的激活開始逐漸獲得功能失調(diào)的表型。為了檢驗這一假設(shè)，作者檢查了效應(yīng)細胞因子在 T 細胞 （IFN-γ、IL-2、顆粒酶 B 和 TNF-α）中的表達。EGFR-TKIs 的初始治療刺激效應(yīng)細胞因子的產(chǎn)生，但在耐藥發(fā)展的后期，效應(yīng)細胞因子的水平似乎降低，并且與 CTRL 相比，IFN-γ 和顆粒酶 B 的產(chǎn)生顯著減少（圖2D， E）。這些結(jié)果表明 EGFR-TKIs 顯著影響腫瘤免疫環(huán)境。初始治療會引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而顯著減少腫瘤生長。隨著時間的推移，EGFR-TKI 無法顯著控制腫瘤生長，并伴有 T 細胞浸潤和細胞因子產(chǎn)生的顯著減少。綜上所述，這些結(jié)果表明，隨著 EGFR-TKIs 治療時間的延長，腫瘤細胞由藥物敏感變?yōu)槟退?，免疫反?yīng)首先增強后抑制。
圖2-腫瘤免疫環(huán)境由激活到抑制的動態(tài)變化驅(qū)動 EGFR-TKIs 耐藥
- 對 EGFR-TKI 的獲得性耐藥伴隨著 PD-L2 表達的上調(diào)
為了探索腫瘤免疫環(huán)境變化的原因，作者同時檢測了不同傳代階段腫瘤組織中刺激性和抑制性免疫調(diào)節(jié)分子的表達。在 EGFR-TKI 的初始治療中，一些抑制性免疫檢查點的相對表達降低（圖隨著耐藥性的出現(xiàn)，抑制性免疫檢查點基因 PD-L1 和 PD-L2 的相對表達水平逐漸升高，尤其是 PD-L2 （圖3A）。為了進一步驗證 PD-L2 在 EGFR-TKI 耐藥腫瘤細胞中表達的增加，作者通過流式細胞術(shù)鑒定了 PD-L2 在 P3 腫瘤細胞厄洛替尼或奧希替尼處理的腫瘤細胞（耐藥，TKI 組）表面的表達，以生理鹽水處理的細胞為對照（敏感，CTRL 組）。作者的結(jié)果表明，與對照組織相比，腫瘤細胞表面 PD-L2 的表達在耐藥腫瘤組織中表現(xiàn)出顯著增加（圖3B）。接下來，為了進一步驗證，作者分析了先前構(gòu)建的 EGFR 突變的 TKI 耐藥 NSCLC 細胞系 HCC4006R、HCC827R、PC9R 及其配對親本細胞中免疫檢查點標(biāo)志物的表達水平。在三種耐藥細胞系中，PD-L2 的 mRNA 和蛋白表達水平顯著上調(diào)，而 PD-L1 的表達表現(xiàn)出不一致的變化（圖3C、D）。
圖3-EGFR-TKI 的獲得性耐藥伴隨著 PD-L2 表達的上調(diào)
為了探索這種現(xiàn)象的臨床價值，作者分析了臨床數(shù)據(jù)庫。使用 GEO 數(shù)據(jù)集，作者分析了 8 例 EGFR TKIs 治療前后切除的臨床患者肺癌組織中 PDCD1LG2?（編碼 PD-L2） 和其他免疫檢查點基因的變化。與作者的結(jié)果類似，作者觀察到 EGFR TKI 治療后患者組織中 PDCD1LG2?表達增加，但其他免疫檢查點相關(guān)基因沒有增加（圖3E）。此外，作者認(rèn)為其他因素，例如 MET 擴增，可能涉及 EGFR-TKI 耐藥。作者利用 TCGA 數(shù)據(jù)集研究了 EGFR-TKIs 耐藥驅(qū)動基因的表達與人 CD274?（編碼 PD-L1） 或 PDCD1LG2?表達之間的關(guān)系。計算各驅(qū)動基因表達水平與 CD274?或 PDCD1LG2?表達水平之間的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，PD-L2 表達而不是 PD-L1 表達與 EGFR-TKIs 耐藥驅(qū)動基因的表達呈顯著正相關(guān)（圖 3F）。與體外實驗中的 PD-L1 過表達細胞相比，PD-L2 過表達的 PC9 細胞對上述耐藥驅(qū)動基因相關(guān)的抑制劑的抵抗力增強（圖3F）。這些結(jié)果與一些研究表明 EGFR-TKIs 耐藥機制與 PD-L1 表達有關(guān)的研究形成鮮明對比?？偠灾?，作者的結(jié)果提供了初步證據(jù)，表明 PD-L2 而不是 PD-L1 可能是介導(dǎo) EGFR-TKIs 治療過程中腫瘤環(huán)境免疫抑制作用和驅(qū)動耐藥的關(guān)鍵分子。
- PD-L2 通過影響腫瘤免疫環(huán)境在介導(dǎo) EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用
為了研究 PD-L2 表達在免疫系統(tǒng)中的獨特作用和對 EGFR-TKI 的反應(yīng)，作者在 CT26-EGFR19del?細胞系中過表達 PD-L1 和 PD-L2，并建立了 BALB/c 同基因小鼠模型（圖 4A）。使用攜帶空載體的 CT26-EGFR19del細胞系作為對照。作者通過測量腫瘤體積評估空載體組、PD-L1 過表達組和 PD-L2 過表達組小鼠腫瘤對厄洛替尼治療的敏感性。結(jié)果顯示，與空載體組相比，PD-L2 過表達組小鼠對厄洛替尼的腫瘤耐藥性顯著增加，但 PD-L1 過表達組對厄洛替尼的腫瘤耐藥性沒有增加（圖4B，C）。這些結(jié)果表明，PD-L2 的過表達會增加腫瘤細胞對 EGFR-TKIs 的耐藥性。為了進一步證實作者的發(fā)現(xiàn)，作者檢查了 PD-L1 或 PD-L2 過表達對 EGFR-TKIs 治療荷瘤小鼠腫瘤免疫環(huán)境中 T 細胞浸潤和細胞因子產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，CD4+?T 細胞占總 CD3+?T 細胞的比例在 3 組間差異不顯著。值得注意的是，與空載體組相比，PD-L2 過表達組的 CD8+?T 細胞占總 CD3+?T 細胞的百分比以及細胞因子 IFN-γ 和顆粒酶 B 的表達顯著降低（圖 4D）。然而，PD-L1 過表達組中的細胞因子 IFN-γ 和顆粒酶 B 沒有顯著變化（圖 4D）。免疫組化染色顯示，與空載體和 PD-L1 過表達組相比，PD-L2 過表達組腫瘤細胞增殖顯著增加（圖4E）。以上結(jié)果進一步表明，PD-L2 在厄洛替尼治療期間在抑制免疫反應(yīng)、抑制細胞毒性 T 細胞浸潤和減少小鼠效應(yīng)細胞因子產(chǎn)生方面起主導(dǎo)作用。因此，作者得出結(jié)論，在 EGFR-TKIs 治療過程中，PD-L2 水平升高通過介導(dǎo)腫瘤細胞的免疫逃逸來抑制腫瘤細胞對 EGFR-TKIs 的治療反應(yīng)。
圖4-PD-L2 通過影響腫瘤免疫環(huán)境在介導(dǎo) EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用
鑒于 PD-L2 在體內(nèi)調(diào)節(jié) T 細胞活性中的關(guān)鍵作用，作者通過體內(nèi)實驗表明，PD-L2 的穩(wěn)定沉默增加了 EGFR-TKI 的敏感性（圖4F，G）。為了進一步研究 PD-L2 如何影響對 EGFR-TKI 的耐藥動力學(xué)，作者在 EGFR-TKI 耐藥同基因小鼠模型的開發(fā)中穩(wěn)定地沉默了 CT26-EGFRmut 細胞系中的 PD-L2（圖4H）。結(jié)果顯示，厄洛替尼在第一代顯著抑制 CT26-EGFR19del?衍生腫瘤的生長。重要的是，PD-L2 沉默導(dǎo)致對 EGFR-TKI 治療的耐藥性延遲發(fā)生。即使在第三代 （P3） 時對照組 （CT26-EGFR19del?shNC 衍生腫瘤） 出現(xiàn)耐藥性 （腫瘤抑制率 = 13.5%），PD-L2 沉默的腫瘤對 EGFR-TKIs 保持高敏感性 （腫瘤抑制率 = 52.7%） （圖4I，J）。綜上所述，作者的基因操作實驗表明，PD-L2 通過影響腫瘤免疫微環(huán)境在介導(dǎo) EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
- 阻斷 PD-L2/PD-1 聯(lián)合 EGFR-TKI 可抑制 EGFR-TKI 耐藥細胞或腫瘤的生長
接下來，作者想進一步探討阻斷 EGFR-TKI 耐藥細胞中的 PD-L2/PD-1 是否可以通過增強免疫反應(yīng)來增強腫瘤細胞對 EGFR-TKIs 的敏感性。作者建立了攜帶對奧希替尼耐藥的 LLC-EGFR19del?衍生腫瘤的同基因小鼠模型。小鼠接受生理鹽水 （CTRL）、奧希替尼 （Os）、抗 PD-1 （αPD-1） 和奧希替尼 + 抗 PD-1 （Combi） 治療（圖5A）。作者的結(jié)果表明，與 CTRL 組相比，單獨使用奧希替尼組小鼠的腫瘤體積和生存時間沒有顯著差異。PD-1 抑制劑對 EGFR-TKI 耐藥腫瘤表現(xiàn)出部分抑制，并導(dǎo)致小鼠存活時間適度延長，盡管沒有統(tǒng)計學(xué)意義。然而，奧希替尼和抗 PD-1 的組合顯著抑制了腫瘤生長并延長了攜帶耐藥腫瘤的小鼠的生存期（圖5B，C）。以上結(jié)果表明，抑制 PD-1 與 EGFR-TKI 聯(lián)合有效抑制了 EGFR-TKI 耐藥腫瘤的生長。
此外，作者進一步確定了在耐藥細胞中穩(wěn)定敲低 PD-L2 是否可以增強這些細胞對 EGFR-TKIs 的敏感性，為了區(qū)分 PD-L1 和 PD-L2 的作用，作者生成了 PD-L1 和 PD-L2 穩(wěn)定沉默的 PC9R 細胞系。與 PD-L1 沉默細胞相比，PD-L2 沉默的腫瘤細胞對 EGFR-TKI 更敏感，它們更有效地增加了 T 細胞的增殖和 CD8+?T 細胞的比例（圖5D，E）。此外，作者使用抗體阻斷 PD-L1、PD-L2 和 PD-1 的功能獲得了一致的結(jié)論?？?PD-L2 和 PD-1 的抗體使腫瘤細胞對 EGFR-TKI 更敏感，并增加了 T 細胞的增殖，CD8+ T 細胞的比例更高（圖5F， G）。上述體內(nèi)和體外實驗表明，PD-L2 的高表達通過影響免疫反應(yīng)來影響 EGFR 突變細胞對 EGFR-TKIs 的敏感性。因此，PD-1/PD-L2 信號傳導(dǎo)，而不是 PD-1/PD-L1 信號傳導(dǎo)，可能在介導(dǎo)對 EGFR-TKI 的耐藥中發(fā)揮重要作用。
圖5-阻斷 PD-L2/PD-1 聯(lián)合 EGFR-TKI 可抑制 EGFR-TKI 耐藥細胞或腫瘤的生長
- PD-L2 過表達抑制腫瘤細胞凋亡并促進對 EGFR-TKI 的耐藥
接下來，作者進一步探討了 PD-L2 表達升高影響免疫反應(yīng)以降低腫瘤對 EGFR-TKIs 敏感性的機制。作者獲得了來自空載體或 PD-L2 過表達的同基因小鼠中 CT26-EGFR19del?細胞的腫瘤組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組譜。作者對來自空載體樣本和 PD-L2 過表達樣本的整合單細胞數(shù)據(jù)集進行了聚類分析，并確定了六個主要的不同細胞群（圖6A、B）。作者發(fā)現(xiàn) PD-L2 過表達組中癌細胞的數(shù)量顯著增加，T 細胞的比例顯著降低（圖6C）。為了探索 EGFR-TKIs 耐藥的機制，作者分析了癌細胞的轉(zhuǎn)錄組特征。與空載體組相比，對 PD-L2 過表達組的差異表達基因進行 KEGG 富集分析。作者觀察到細胞凋亡通路顯著富集（圖 6D）。GSEA 分析顯示，PD-L2 過表達組癌細胞中與細胞凋亡途徑相關(guān)的基因顯著下調(diào)（圖6E）。這些結(jié)果表明，EGFR 突變腫瘤細胞中 PD-L2 表達的增加可導(dǎo)致細胞凋亡減少。作者的體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)進一步驗證了這些結(jié)論。TUNEL 染色顯示，與對照組相比，TKI 處理后 CT26-EGFR19del?PD-L2 過表達組腫瘤細胞凋亡受到顯著抑制（圖6F）。基于這些結(jié)果，作者假設(shè) EGFR 突變的腫瘤細胞中 PD-L2 表達增加會抑制癌細胞的凋亡，從而導(dǎo)致癌細胞的持續(xù)生長，耐藥性增加。
圖6-PD-L2 過表達抑制腫瘤細胞凋亡并促進對 EGFR-TKI 的耐藥
- PD-L2 過表達抑制 CD8+T 細胞通過穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的功能
為了進一步了解 PD-L2 對腫瘤免疫環(huán)境的抑制作用，作者回到了作者的單細胞測序數(shù)據(jù)。根據(jù) CD45 的表達，將空載體和 PD-L2 過表達組的腫瘤環(huán)境中細胞分為 CD45-?腫瘤細胞和 CD45+?免疫細胞（圖7A）。然后根據(jù)已知遺傳標(biāo)記的表達和細胞亞群的特異性注釋對 CD45+?免疫細胞進行分組（圖 7B）。在 PD-L2 過表達組中，作者觀察到 CD8+?T 細胞群的大小顯著減?。▓D7B，C）。因此，作者通過 KEGG 富集分析了空載體組和 PD-L2 過表達組 CD8+?T 細胞中的差異表達基因（圖 7D）。作者發(fā)現(xiàn)與增殖和細胞毒功能相關(guān)的通路顯著富集（圖7E）。為了進一步證實 PD-L2 過表達顯著影響 CD8+?T 細胞活性，作者從總 T 細胞中分離 CD8+?T 細胞，并將它們與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細胞共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，CD8+?T 細胞的增殖在 PD-L2 過表達細胞中受到顯著抑制，而在 PD-L1 過表達細胞中則不受抑制（圖7F）。然后，作者從總 T 細胞中分離 CD4+?T 細胞，并將它們與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細胞共培養(yǎng)。值得注意的是，PD-L2 過表達對 CD4+?T 細胞的增殖沒有影響，而 PD-L1 過表達顯著抑制了 CD4+?T 細胞的增殖（圖7G）。這表明 PD-L2 和 PD-L1 介導(dǎo) T 細胞抑制的分子機制存在差異。
許多研究表明，CD8+?T 細胞可通過 Fas-FasL 通路或穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。因此，作者接下來使用純化的 CD8+?T 細胞與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細胞共培養(yǎng)，并研究 EGFR-TKIs 處理后腫瘤細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，與 PD-L1 過表達細胞相比，PD-L2 過表達減少了 EGFR-TKI 處理后 CD8+?T 細胞介導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡（圖7H）。接下來，作者試圖檢查腫瘤細胞 PD-L1 或 PD-L2 過表達對 CD8+?T 細胞分泌細胞毒性細胞因子的影響。正如預(yù)期的那樣，與 PD-L1 過表達相比，PD-L2 過表達顯著抑制了 CD8+?T 細胞顆粒酶 B 和穿孔素伴隨 EGFR-TKI 治療的分泌（圖7I）。綜上所述，EGFR 突變腫瘤細胞中 PD-L2 的過表達顯著抑制了 CD8+?T 細胞的增殖和細胞毒功能，主要是通過抑制穿孔素和顆粒酶 B 的分泌，從而減少腫瘤細胞的凋亡。
圖7-PD-L2 過表達抑制 CD8+?T 細胞通過穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的功能
- ZU 作為天然存在的 PD-L2 小分子抑制劑的篩選和活性評價
由于目前市場上沒有靶向 PD-L2 的藥物，作者使用 HTRF 技術(shù)篩選了 1300 多種天然小分子化合物的庫，以鑒定 PD-L2 的特異性抑制劑。作者發(fā)現(xiàn)了一種小分子化合物十一烯酸鋅 （ZU），它選擇性地抑制 PD-L2/PD-1 結(jié)合，EC50?8.4 μM，而 PD-L1/PD-1 為 >80 μM（圖8A， B）。ZU 是由蓖麻油通過一系列化學(xué)反應(yīng)和凈化過程生產(chǎn)的。CETSA 實驗表明，與 PD-L1/PD-1 相比，ZU 有效抑制了 PD-L2 與 PD-1 的結(jié)合（圖8C）。這些結(jié)果表明 ZU 具有阻斷 PD-L2/PD-1 相互作用的特異性能力。此外，作者利用空載體或 PD-L2 過表達的小鼠 CT26 細胞來驗證 ZU 的體外抗腫瘤作用。在 40 μM 濃度下，ZU 不會顯著降低 CT26 空載體和 PD-L2 過表達細胞的活力（圖8D），這表明 ZU 沒有直接的細胞毒性作用。然而，當(dāng)腫瘤細胞與活化的 T 細胞共培養(yǎng)時，與 CT26 空載體細胞相比，ZU （40 μM） 顯著抑制了 CT26 PD-L2 過表達細胞的活力（圖8D）。這表明 ZU 通過靶向 PD-L2/PD-1 的免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用。使用具有空載體和 PD-L2 過表達的 PC9 細胞獲得了類似的結(jié)果（圖8D）。此外，作者研究了 ZU 和 EGFR-TKI 對親本和 TKI 耐藥 NSCLC 細胞的聯(lián)合抑制作用。對于耐藥細胞，結(jié)果表明，厄洛替尼聯(lián)合 ZU 對 827 R 或 PC9R 細胞的生長抑制具有協(xié)同作用，與單獨使用厄洛替尼相比，耐藥細胞的存活率顯著降低（圖8E）。重要的是，在沒有活化的 T 細胞的情況下，厄洛替尼聯(lián)合 ZU 的細胞殺傷效果沒有顯著差異（圖8E）。上述結(jié)果進一步表明，靶向 PD-L2 的 ZU 與 EGFR-TKI 的組合對耐藥腫瘤表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。
接下來，作者評估了 ZU 是否通過靶向 PD-L2 可以改善腫瘤免疫反應(yīng)。流式細胞術(shù)分析顯示，與單獨使用厄洛替尼或 ZU 相比，厄洛替尼聯(lián)合 ZU 顯著增加了 CD8+?T 細胞的比例和顆粒酶 B 的表達（圖8F，G）。作者進一步檢測到與活化 T 細胞共培養(yǎng)的 827 個 R 或 PC9R 細胞的凋亡水平。作者發(fā)現(xiàn)厄洛替尼聯(lián)合 ZU 顯著促進免疫細胞介導(dǎo)的 EGFR-TKI 耐藥細胞凋亡（圖8H）。相比之下，當(dāng)用厄洛替尼加 ZU 處理耐藥細胞時，在沒有活化的 T 細胞或細胞凋亡抑制劑（泛半胱天冬酶抑制劑 Z-VAD-FMK 和特異性顆粒酶 B 誘導(dǎo)的細胞凋亡抑制劑 Z-IETD-FMK）的情況下未觀察到細胞凋亡（圖8H）。這進一步證明了耐藥細胞的凋亡是由免疫細胞介導(dǎo)的。此外，顆粒酶 B （Z-IETD-FMK） 的抑制有效地消除了細胞凋亡，突出了顆粒酶 B 在 ZU 和 EGFR-TKI 誘導(dǎo)的耐藥癌細胞凋亡中的關(guān)鍵作用（圖8H）。總之，這些結(jié)果表明天然小分子抑制劑 ZU 可以有效和特異性地抑制 PD-L2。當(dāng)與 EGFR-TKIs 聯(lián)合使用時，ZU 可以通過在體外激活免疫細胞介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來顯著逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性。
圖8-ZU 作為天然存在的 PD-L2 小分子抑制劑的篩選和活性評價
- ZU 改善抑制性腫瘤免疫環(huán)境，在體內(nèi)逆轉(zhuǎn) EGFR-TKIs 耐藥
為了進一步證實 ZU 和 EGFR-TKIs 的組合協(xié)同改善腫瘤免疫環(huán)境并逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性，作者評估了 ZU + 厄洛替尼在攜帶 PD-L2 過表達的 CT26-EGFR19del?來源的腫瘤的 BALB/c 同基因小鼠中的療效（圖9A）。腫瘤體積曲線顯示，與鹽水處理組相比，單獨使用厄洛替尼在治療 15 天后表現(xiàn)出邊緣性腫瘤生長抑制（圖9B），這表明 PD-L2 的過表達增加了腫瘤細胞對 TKI 的耐藥性。ZU 單次治療并未阻斷腫瘤生長（圖9B），這表明單獨靶向 PD-L2 不能逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥性。正如預(yù)期的那樣，陽性對照組 （Er + ADVshPD-L2） 在所有測試的模型中反應(yīng)最好（圖9B）。此外，ZU + 厄洛替尼組與陽性對照組相比沒有顯著差異，這表明 ZU 可以有效抑制 PD-L2，并且當(dāng)與厄洛替尼聯(lián)合使用時，可以顯著逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥性（圖9B）。此外，流式細胞術(shù)和免疫組化結(jié)果顯示，聯(lián)合治療增加了腫瘤組織中浸潤白細胞（CD45+）的比例、T 細胞的活化 （CD3+CD69+）以及CD8+?T 細胞（CD8+GzmB+）的比例和功能（圖9C）。免疫組化顯示，聯(lián)合治療顯著抑制了增殖（圖9D）。為了全面評價 EGFR-TKIs 聯(lián)合 ZU 的療效，作者建立了攜帶對奧希替尼耐藥的 LLC-EGFR19del?衍生腫瘤和對厄洛替尼耐藥的 CT26 EGFR19del?衍生腫瘤的同基因小鼠模型。小鼠接受生理鹽水（CTRL）、單獨 EGFR-TKIs、 單獨 ZU和EGFR-TKIs + ZU處理。作者的結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，單獨使用 EGFR-TKIs 組或單獨使用 ZU 組小鼠的生存時間沒有顯著差異（圖9E， F）。然而，ZU 和 EGFR-TKIs（奧希替尼或厄洛替尼）的組合顯著延長了攜帶耐藥腫瘤的小鼠的生存期（圖9E，F(xiàn)）。這些結(jié)果表明，ZU 聯(lián)合 EGFR-TKIs 可以通過改善同基因小鼠模型中的腫瘤免疫環(huán)境來有效逆轉(zhuǎn)對 EGFR-TKIs 的耐藥性。綜上所述，ZU 通過抑制 PD-L2 增強 CD8+?T 細胞的功能，其與 EGFR-TKIs 的聯(lián)合作用可有效抑制耐藥腫瘤的增殖。
圖9-ZU 改善抑制性腫瘤免疫環(huán)境，在體內(nèi)逆轉(zhuǎn) EGFR-TKIs 耐藥
研究總結(jié)
在該研究中，由于難以獲得對?EGFR-TKIs?耐藥的臨床腫瘤樣本，作者使用轉(zhuǎn)染人?EGFR?突變體 （外顯子19?缺失） 的小鼠細胞系建立?EGFR-TKI?耐藥同基因小鼠模型約五個月，這是使用基因工程小鼠難以實現(xiàn)的。值得注意的是，該研究的?TKI?耐藥模型的關(guān)鍵點是將初始抑制率與不同傳代模型中的抑制率進行了比較，例如?Os?治療的?LLC?從?44%?到?-12.3%，Er?治療的?CT26?從?55%?到?11.2%。因此，該研究認(rèn)為該模型可以反映臨床?TKI?給藥中的耐藥過程。這種方法使作者能夠研究?EGFR-TKIs?治療過程與腫瘤免疫環(huán)境之間的關(guān)系。作者的結(jié)果表明，EGFR-TKIs?對腫瘤免疫環(huán)境具有顯著而顯著的影響。當(dāng)?EGFR-TKIs?治療有效時，抗腫瘤免疫反應(yīng)增強。然而，當(dāng)發(fā)生耐藥性時，作者觀察到腫瘤浸潤白細胞的比例顯著降低，CD8+?T?細胞的比例和功能降低。不斷變化的腫瘤免疫環(huán)境可能是?PD-1?阻斷治療后立即再次用?EGFR-TKIs?攻擊對?EGFR-TKI?耐藥的?NSCLC?患者有效的原因 。此外，作者得出結(jié)論，抑制性腫瘤免疫環(huán)境是參與對?EGFR-TKIs?耐藥的機制之一。因此，作者從非遺傳角度揭示了?EGFR-TKIs 耐藥的新機制。